🔥 transwell 实验

细胞迁移是指细胞在外界信号的作用下从一个位置（区域）移动到另一个位置（区域）的过程，这个过程在生物体内发挥着非常重要的生理和病理学作用，比如损伤修复、肿瘤转移、免疫细胞的迁移、组织修复等。

细胞迁移实验是一种常用的体外实验方法，用于评估细胞迁移能力的变化，以及探究与细胞迁移相关的分子机制。

显微镜、Transwell 小室、细胞培养板孔板、无血清 DMEM、10% 胎牛血清、DMEM 和 1640 培养基、DMEM 完全培养基、1640 完全培养基（也可加到 20% 血清）、无菌 PBS、棉签、胰酶、4% 多聚甲醛固定液、结晶紫染液。

1.使用前进行基底膜水化

每孔加 50 μl 无血清培养液，37℃ 室温下 30 min 进行基底膜水化。

2.制备细胞悬液

①先让细胞撤血清饥饿 12～24 h，进一步去除血清的影响。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用 PBS 洗 1～2遍，用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至 5×10⁵ 个/ml。

3.接种细胞

①取细胞悬液 100 μl 加入 Transwell 小室。

②孔板下室加入 600 μl 含 10% FBS 的培养基。

③培养细胞：常规培养 12～48h（主要依细胞迁移能力而定）。

4.结果统计

直接计数法，「贴壁」细胞计数，这里所谓的「贴壁」是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色可在镜下计数细胞。

取出 Transwell 小室，弃去孔中培养液，用无钙的 PBS 洗 2 遍，甲醇固定 30 分钟，将小室适当风干。

0.1% 结晶紫染色 20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用 PBS 洗 3 遍。荧光显微镜下随即五个视野观察细胞，记数，取平均值，统计分析。

1. 下层培养液和小室间常会有气泡产生。一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，因此在种板的时候要特别留心。一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

2. 培养细胞的时间为 24h 较常见。时间点的选择除了要考虑到细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

3. Transwell 孔径的选择需要考虑实验的目的和实验细胞的大小。如不涉及研究细胞运动能力通常是选择 4 μm 或者 3 μm。

4. 细胞悬液的制备数量要合适：

细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；

而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

5. 细胞在小室内的形态有可能不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，属正常现象（别人的经验，注意观察）。

6. 如果研究细胞侵袭实验，则需要在第一步进行 Matrigel 基质胶铺板。

7. 细胞接种时尽量均匀，建议沿着壁缓慢加入。