🔥 内皮细胞 HMEC-1 迁移实验——transwell

Transwell 是一种实验技术，这项技术的主要材料是 Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert）。Transwell 小室外形如同一个小杯子，杯底有通透性的膜（孔径 0.1-12.0 µm，细胞迁移需要选择孔径较大的小室以便细胞穿过膜，一般用 8.0、12.0 μm）。

将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下室以膜（以聚碳酸酯为例）隔开，上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液。将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，在生长因子的诱导刺激下内皮细胞可以透过膜进行迁移。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

显微镜、Transwell 小室、细胞培养板孔板、DMEM 和 RPMI1640 无血清培养基及完全培养基、无菌 PBS、棉签、胰酶、甲醛固定液、0.1% 结晶紫染液。

使用 transwell 方法检测内皮细胞迁移的步骤如下：

1、用 1% 的明胶将 transwell 小室包被，放入培养箱中孵育，30 min 后吸掉明胶，用 PBS 洗 3 次。

2、细胞处理：用无血清培养基培养内皮细胞 HMEC-1，去除血清的影响。

3、制备细胞悬液：取对数生长期的细胞，用 PBS 洗一次，加胰酶消化细胞，至拍打培养皿则浮起则表示消化完成。1 000 rpm 5 min 离心沉淀细胞并弃去上清液，加入 1 ml 无血清培养液重悬细胞，计数，调整浓度至 2×10⁵ 个/ml。

4、接种细胞：在 transwell 上室加入 100~150 μl 细胞悬液。

5、培养细胞：在 transwell 下室加 700 μl 含 20% FBS 的完全培养基，放入培养箱中培养 5 h 后拿出。

6、固定细胞：用棉签轻轻擦去上层小室的细胞，先将 transwell 小室弃去上层液体，并置于 4% 的多聚甲醛中浸泡 15 min。

7、用 PBS 清洗 3 次小室（每次慢摇 5 min），0.1% 结晶紫室温染色 15 min，后用 PBS 洗 3 遍；

8、将染色后的小室拿去外面的 50 ml 离心管中 PBS 中涮洗；拿棉签沾去小室上层未穿透细胞；

9、高倍显微镜下进行观察和拍照，随机选取 5 个视野（上、下、中央、左、右各 1 个）计数呈紫色的阳性细胞，统计结果。使用 Image J 计数迁移的细胞并进行统计分析绘制柱状图。

1. 铺细胞时，上层一般铺到 100 μl，尽量过量。

2. 最终上室应有 300 ul 体系，按调整的细胞悬液体积再加入无血清培养基补齐，同时要垂直加样，不要有气泡。

3. 棉签注意可以保持棉花松软，从而可以擦到小室边角。

4. 水洗时间不必过长，镜下观察。

5. 如果进行细胞侵袭实验，则需要在第一步进行 Matrigel 基质胶铺板。