提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

🔥 内皮细胞 HMEC-1 迁移实验——transwell

相关实验:🔥 transwell 细胞迁移实验

最新修订时间:

丁香实验推荐阅读

合作专家 | 李锦斐博士

肿瘤学 北京协和医学院

丁香实验推荐阅读

审核专家 | 张望博士

感染病学 浙江大学

简介

Transwell 是一种实验技术,这项技术的主要材料是 Transwell 小室(Transwell chamber,Transwell insert)。Transwell 小室外形如同一个小杯子,杯底有通透性的膜(孔径 0.1-12.0 µm,细胞迁移需要选择孔径较大的小室以便细胞穿过膜,一般用 8.0、12.0 μm)。

原理

将小室放入培养板中,小室内称为上室,培养板内称为下室,上下室以膜(以聚碳酸酯为例)隔开,上室内添加上层培养液,下室内添加下层培养液。将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,在生长因子的诱导刺激下内皮细胞可以透过膜进行迁移。

用途

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

材料与仪器

显微镜、Transwell 小室、细胞培养板孔板、DMEM 和 RPMI1640 无血清培养基及完全培养基、无菌 PBS、棉签、胰酶、甲醛固定液、0.1% 结晶紫染液。

步骤

使用 transwell 方法检测内皮细胞迁移的步骤如下:

1、用 1% 的明胶将 transwell 小室包被,放入培养箱中孵育,30 min 后吸掉明胶,用 PBS 洗 3 次。

2、细胞处理:用无血清培养基培养内皮细胞 HMEC-1,去除血清的影响。

3、制备细胞悬液:取对数生长期的细胞,用 PBS 洗一次,加胰酶消化细胞,至拍打培养皿则浮起则表示消化完成。1 000 rpm 5 min 离心沉淀细胞并弃去上清液,加入 1 ml 无血清培养液重悬细胞,计数,调整浓度至 2×105 个/ml。

4、接种细胞:在 transwell 上室加入 100~150 μl 细胞悬液。

5、培养细胞:在 transwell 下室加 700 μl 含 20% FBS 的完全培养基,放入培养箱中培养 5 h 后拿出。

6、固定细胞:用棉签轻轻擦去上层小室的细胞,先将 transwell 小室弃去上层液体,并置于 4% 的多聚甲醛中浸泡 15 min。

7、用 PBS 清洗 3 次小室(每次慢摇 5 min),0.1% 结晶紫室温染色 15 min,后用 PBS 洗 3 遍;

8、将染色后的小室拿去外面的 50 ml 离心管中 PBS 中涮洗;拿棉签沾去小室上层未穿透细胞;

9、高倍显微镜下进行观察和拍照,随机选取 5 个视野(上、下、中央、左、右各 1 个)计数呈紫色的阳性细胞,统计结果。使用 Image J 计数迁移的细胞并进行统计分析绘制柱状图。

注意事项

1. 铺细胞时,上层一般铺到 100 μl,尽量过量。

2. 最终上室应有 300 ul 体系,按调整的细胞悬液体积再加入无血清培养基补齐,同时要垂直加样,不要有气泡。

3. 棉签注意可以保持棉花松软,从而可以擦到小室边角。

4. 水洗时间不必过长,镜下观察。

5. 如果进行细胞侵袭实验,则需要在第一步进行 Matrigel 基质胶铺板。

来源:丁香实验

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序