简介
通过组织学观察初步判断病理发展情况后，通常需要进一步在原位确认潜在的高/低表达分子，以推测病理表型的分子基础。此时就需要使用免疫组织化学的方法，定性/半定量地考察目的蛋白的表达情况。有时为了更精确地确定蛋白表达的确切位置，需要使用与标志蛋白共定位的免疫荧光手段实现多个分子共染，并在共聚焦显微镜下独立通道扫描叠加图像取得高分辨率的荧光共染结果。
材料与仪器
器材：60 ℃ 温箱、湿盒、（荧光）体式显微镜
试剂：
① 二甲苯
② 无水乙醇
③ 3％ 过氧化氢
④ 特定的一抗
⑤ 二抗及 DAB 检测系统
⑥ 苏木素
步骤
免疫组化（荧光）实验的基本过程可分为如下几步：
A. 组织切片置于二甲苯中浸泡 10 分钟或更久，更换二甲苯后再浸泡 10 分钟以上。
B. 无水乙醇中浸泡 3～5 分钟。
C. 95％ 乙醇中浸泡 3～5 分钟。
D. 70％ 乙醇中浸泡 3～5 分钟，蒸馏水洗。
E. 3％ 过氧化氢孵育 10～30 分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。
F. 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5 分钟。
G. 采用抗原修复：蒸锅修复 30 分钟，自然冷却。
H. 血清封闭：室温 15～30 分钟，与二抗来源一致。弃去，勿洗。
I. 滴加适当比例稀释的一抗，4 ℃ 过夜。第二天复温后 PBS 冲洗，3 分钟（5 次）。
J. 滴加生物素标记的二抗，室温或 37 ℃ 孵育 30 分钟。
K. PBS 冲洗，3 分钟（3 次）。
L. 滴加 SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或 37 ℃ 孵育 30 分钟。
M. PBS 冲洗，3 分钟（3 次）。
N. DAB 显色，在显微镜下掌握显色程度。
O. PBS 或自来水冲洗 5 分钟。
P. 苏木素复染片刻，核淡染即可，氯化铵返蓝。
Q. 馏水洗去多余盐溶液。
R. 常规脱水、透明、封片，封固后可长期保存。
注意事项
1. 使用防脱处理的玻片，防止处理过程中尤其是过氧化氢处理时标本从玻片上脱落。
2. 抗原修复常用的修复方法有高压修复、微波或蒸气修复、胰酶修复。我们一般用 pH6.0 的 0.01 mol/L 柠檬酸缓冲液浸没切片，蒸锅修复 30 分钟左右。注意修复后自然冷却修复液的温度达室温。
3. 血清封闭 封闭血清一般是和二抗同一物种来源，如山羊血清封闭液，也可以用小牛血清、BSA 等，但不能与一抗来源一致。一般室温 10～30 分钟，防止封闭过度影响一抗结合力。
4. 一抗和二抗浓度和孵育时间 一抗孵育条件在免疫组化反应中最为重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度，需要根据具体情况进行摸索，一般根据抗体说明书提供的起始浓度开始并进行调整。一抗孵育温度有几种：4 ℃、室温、37 ℃，其中 4 ℃ 效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 4℃ 过夜。二抗孵育条件：二抗一般室温或 37 ℃ 孵育 30～60 分钟，具体时间需要摸索。
5. DAB 显色背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由 DAB 孵育条件决定。DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗。
6. 封片为了长期保存，我们一般用中性树胶封片，从一侧慢慢盖上盖玻片，避免产生气泡。结果示例如图 8-2-5 所示。
免疫荧光与免疫组化步骤相似，一般使用冷冻切片，不需要进行抗原修复及内源性过氧化氢酶的灭活。使用两种或两种以上不同种属来源的一抗，并用不同荧光标记的二抗加以区分，加入合适的细胞核标记物如 DAPI 显示组织形态，使用 15％～30％ 的甘油/PBS 进行封片。完成的制片可以在 4 ℃ 保存 1 周，但最好在最短的时间内观察拍照，以保持组织形态的完整。结果示例如图 8-2-6 所示。
来源：丁香实验
