1.抗体问题
一抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色,建议用高纯度,高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。单克隆抗体很贵,不过结果真的很好。尤其是背景非特异性染色不会太深。真是一分价钱一分货。一抗过期也会造成杯具,所以要注意抗体的有效期。
2.抗体浓度过高/孵育时间过长
一抗浓度太高也是出现非特异性染色的常见原因。解决的办法就是预实验。每次使用新抗体前应该多做预实验,摸索出最理想的工作浓度,不能简单地按照说明书来用。另一个常见原因就是孵育时间过长。解决的办法就是定时器。加上抗体后,立刻调好定时器,提醒自己及时终止反应,就会避免这个问题。
3.DAB染色时间太长/变质
DAB的孵育时间过长,会造成背景非特异性染色。DAB的显色时间不是一成不变的,主要靠自己在显微镜下盯着,一旦出现浅浅的棕色的时候,就要马上冲洗。出现棕色的时间过短,表明抗体浓度过高;出现棕色的时间过长,表明抗体浓度过低。DAB要保存于避光干燥的地方,现用现配,临用前才加入H2O2。