whole mount免疫荧光染色抗体孵育时3D细胞团散了

下面是一些可能的原因：

固定过程中使用的PFA浓度或固定时间过长可能会导致细胞球破裂。你使用了4%的PFA，这个浓度对于不同的细胞类型可能有不同的影响，过浓的PFA浓度或固定时间过长可能会破坏细胞膜，导致细胞球破裂。建议使用更低浓度的PFA，比如1% PFA，在更短时间内固定细胞。

梯度转移过程中可能会出现问题。转移到MeOH中的过程可能会导致细胞球破裂。此外，转移到PBS的过程中，可能出现过度搅拌或过度震动的情况，也可能导致细胞球破裂。建议梯度转移时注意轻轻操作，避免搅拌过度。

孔板处理过程中的穿膜过程可能会破坏细胞球。在处理过程中，细胞球可能会碰到孔板壁或者穿膜过程中的剪切力，导致细胞球破裂。建议在穿膜的过程中注意轻轻操作。

封闭和抗体处理过程中可能会导致细胞球破裂。在封闭和抗体处理过程中，细胞球可能会受到温度、剪切力、抗体等多种因素的影响，导致细胞球破裂。建议在处理过程中注意细胞球的状态，减少对其的干扰。

考虑是在pbs中封闭的时间过长，或者浓度过大，可以减少封闭时间