免疫组化实验

1. 抗体

一抗的选择，二抗的选择

2. 仪器：

恒温培养箱、高压锅、移液器、枪头，摇床、试剂缸等

3. 试剂：

二甲苯、无水乙醇、甲醇、过氧化氢、中性树胶、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等，血清封闭液、一抗稀释液、DAB显色液，柠檬酸缓冲液等为北京德元国际科技有限公司提供。

4.实验步骤:

1. 洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中, ,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面。

2. 切片：将包埋好的组织，并置于石蜡切片机上，切片3.5um，放到载玻片上，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37°C恒温箱中烘干。

3. 脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，一般在每个试剂中放10min。

4. 抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入过氧化物酶封闭液浸（德元国际 LY75069）泡10min，然后倒，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液（德元国际LY7505），高压122Kpa沸热修复，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温。

5. 血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加入山羊血清封闭液（德元国际LY7515）孵育15min。

6. 加一抗：用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，直接加一抗，加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。

7. 加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上HRP标记二抗,然后置于37°C温箱中半小时。二抗中加入0.05%的Tween-20。

8. PBS清洗三次每次5min.。

9. DAB显色：将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上DAB显色剂（德元国际LY7502），孵育3-10min，具体时间根据显色情况判断。

10. 复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于改良苏木素（德元国际LY7501）中染色1-3min,具体时间根据染色情况判断。

11. 脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。

12. 封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。

13. 镜下观察