免疫组化双染实验protocol

第一抗体的染色：

1、 将切片浸在3％H2O2甲醇溶液（新鲜配制）中10分钟，PBS冲洗2分钟×3次

2、 加100ul（2滴）血清封闭溶液（试剂1）到切片上，室温孵育10分钟，倒掉（不能冲洗）

3、 加入一抗（按照说明推荐浓度和孵育条件）

4、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)，冲洗2分钟×3次

5、 加入100ul（2滴）生物素化的二抗（试剂2)，室温孵育10分钟

6、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次

7、 加入100ul（2滴）链霉亲和素-AP（试剂3）的二抗，室温孵育10分钟

8、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次

9、 准备底物溶液：将1滴试剂4A和4B加入到1ml去离子水中，充分混匀；再加入1滴试剂4C，充分混匀

10、 加100ul（2滴）配好的AP底物溶液，室温孵育（镜下检测孵育时间）

11、 使用含有0.05％吐温20的去离子水冲洗终止反应

第二抗体的染色：

12、 加100ul（2滴）双染增强剂（试剂7），孵育

13、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)，冲洗2分钟×3次

14、 加100ul（2滴）血清封闭溶液（试剂1）到切片上，室温孵育10分钟，倒掉（不能冲洗）

15、 加入稀释好的一抗（按照说明推荐浓度和孵育条件）

16、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)，冲洗2分钟×3次

17、 加入100ul（2滴）生物素化的二抗（试剂2)，室温孵育10分钟

18、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次

19、 加入100ul（2滴）链霉亲和素-HRP（试剂5）的二抗，室温孵育10分钟

20、 使用含有0.05％吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次

21、 准备底物溶液：将1滴试剂6A和6B加入到1ml去离子水中，充分混匀；再加入1滴试剂6C，充分

混匀：

22、 加100ul（2滴）配好的HRP底物溶液，室温孵育（镜下检测孵育时间）

23、 使用含有0.05％吐温20的去离子水冲洗终止反应

24、 使用复染试剂染色（根据需要选择）

25、 封片剂（试剂8）封片，显微镜观察结