求助 | 细胞彗星实验protocol

细胞彗星实验主要步骤

1.单细胞悬液制备

（1）悬浮细胞：细胞悬浮液经离心分离获得。将细胞以1×105个/ml的速度悬浮于1X PBS(不含Ca+和Mg+)中。

（2）贴壁细胞：轻轻从皿底分离细胞。将细胞和培养基转移到离心管中，进行细胞计数。用1X PBS (不含Ca+和Mg+)冰洗一次。将细胞以1×105个/ml的速度悬浮于1X PBS(不含Ca+和Mg+)中。

（3）组织制备：称取组织约0.05 g，加入制备缓冲液（含20 mmol/L EDTA-Na2的PBS）立即剪碎，冲洗。迅速研磨组织，过滤，整个过程在冰上操作。离心重悬，计数单细胞悬液密度约在为1×105～4×105个/mL。

2.制片、裂解、解旋及电泳

（1）取120μL浓度为电泳胶A趁热铺于磨砂载玻片上，形成底胶，用盖玻片推匀，不能有气泡，4℃凝固20min。

（2）水平取下盖片，取80 μL电泳胶B与20μl细胞悬液混匀，立即铺片，加上盖玻片，4℃凝固5min，形成第二层胶。再取80μL电泳胶B铺在第二层胶上，4℃凝固5min，形成第三层胶。保证细胞均匀分布于每孔，每个样本平行2孔。

（3）细胞裂解

将玻片置于平皿中，加入预冷的裂解液（裂解液：DMSO=10:1），4℃过夜裂解，裂解液平面刚好没过玻片表面。裂解后，倒掉裂解液，用超纯水清洗3次，5min/次。

4、解旋

加入预冷的解旋液（pH＞13）没过玻片，4℃避光解旋1h。

5、电泳

预先将电泳槽置于冰盒内，冷却备用。将解璇后的细胞玻片置于电泳槽，倒入电泳液，调整电压 22-24V，电流约为300Ma，电泳20min。电泳结束后，取出玻片，轻轻擦拭，去除多余液体。

超纯水清洗2遍，无水乙醇脱水1遍，5min/次。37℃烘干。

3.染色、拍照及分析

染色时将稀释过的Gene Red : Tris-Hcl 1:6000，加到玻片每孔表面，每孔100μL，避光染色30分钟。超纯水清洗3遍，去除多余液体，37℃烘干或室温避光晾干。

拍照前关闭实验室光源，使用CASP1.2.3beta2彗星图像分析软件进行分析，每只动物都要分析150个可分析的尾DNA含量百分率的中位数。分析过程中如遇刺猬细胞进行标记。

以下是一般的细胞彗星实验（Comet Assay）的基本步骤和协议：

1. 培养细胞：选择合适的细胞系，并按照适当的培养条件培养细胞。

2. 细胞处理：根据实验需求，处理细胞，例如暴露于DNA损伤剂（如紫外线、化学物质等）或其他刺激。

3. 细胞收集：收集细胞，可以通过常规的细胞收获方法（如胰酶消化、细胞离心等）将细胞从培养皿中收集。

4. 细胞凝胶电泳：将细胞悬浮在低熔点琼脂糖（Low-melting agarose）中，然后将混合物均匀涂在预涂盖玻片上。等待琼脂糖凝固。

5. 细胞裂解：在细胞凝胶上加入细胞裂解液，以裂解细胞膜和细胞核，并释放DNA。

6. 碱性电泳：将裂解的细胞在碱性缓冲液中进行电泳。这将导致DNA碱解成碱基片段，形成彗星形状。

7. 中和：将碱性电泳后的样品在中和缓冲液中进行中和，以稳定DNA的碱性断裂。

8. 染色：使用DNA染色剂（如SYBR Green）染色，以增强彗星形状的可视化。

9. 彗星图像采集和分析：使用显微镜和图像分析软件，对彗星形状的DNA进行图像采集和分析。可以评估彗星尾长、尾百分比、DNA损伤程度等指标。

需要注意的是，具体的细胞彗星实验协议可能会因实验目的、细胞类型和实验条件的不同而有所变化。建议在设计和执行实验时参考相关的研究文献和专家建议，以获取更具体和适合的细胞彗星实验协议。

实验步骤

将细胞加PBS，冲洗1次，离心后将细胞浓度调整为106～107个/ml，立即进行以下步骤。

(1) 胶板的制备

① 第一层胶的制备：将已预热56℃的80μl 0.5%正常熔点琼脂糖NMA（溶于无Ca2+，Mg2+的磷酸缓冲液PBS）滴到同样预热的载玻片的磨砂面，迅速盖上干净的盖玻片，4℃放置10min使其凝固。

② 第二层胶的制备：取10μl含1000个细胞的PBS和75μl 0.5%低熔点琼脂糖LMA（溶于无Ca2+，Mg2+的磷酸缓冲液PBS）在37℃混匀，然后轻轻揭去盖玻片，将含细胞的LMA滴到第一层胶板上，立即盖上干净的盖玻片，4 ℃ 放置10min使其凝固。

③ 第三层胶的制备：最后在凝固的LMA层上滴加85μl预热37 ℃ 的0.5% LMA，盖上盖玻片，使其凝固。第一层胶的主要目的是使第二层平整和附着紧密，第三层胶的目的是对第二层细胞起保护作用。

(2) 细胞裂解 移去盖玻片，将载玻片浸入新配置的细胞裂解液中至少裂解1h（在放第一片开始计时，再以同样的顺序取出，确保每张片子裂解时间相同）。此步骤的目的是溶解细胞膜及核膜，除去蛋白质、RNA等，仅存留核骨架。

(3) DNA碱解旋 细胞裂解后，取出载玻片，用PBS冲洗2次，以去掉载玻片表面高浓度的盐，然后将载玻片置于水平电泳槽中，倒入新配置的碱性电泳缓冲液，约覆过胶面0.25cm。碱解旋20min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋形成单链DNA，使DNA断链，在电泳场中易于迁移。

(4) 单细胞电泳 在25v、300mA条件下电泳20min。

(5) 中和与染色 电泳完毕后，将载玻片取出，滤纸吸干电泳缓冲液，用Tris-HCl（pH7.5）中和15min。然后每片载玻片上滴加50μl 30μg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，避光操作，盖上盖玻片，避光染色20min，即可观察。

(6) 试验结果观察与数据处理 EB染色后的样本尽快在荧光显微镜下观察并拍照电泳图谱。①计算拖尾率，并利用统计软件SPSS 10.0进行X2 检验。② 对每张组织片子的细胞，利用Comet Assay Software Pect (CASP 1.2.3 beta 1) 图像分析软件 对彗星图像进行指标分析，用 X(—) ±SE表示彗星全长( CL) 、尾长( T L) 、尾矩( TM) 和Olive 尾距( OTM)，并利用统计软件SPSS 10.0分析，显著性比较采用t 检验。