彗星实验在环境毒理学中的应用实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

步骤

一、材料

1.溶液

$1.10\不含〇 32+和 ^ % 2+的磷酸盐缓冲液（卩： 63): 1.31〇1〇 1/1^他〇 1， 50 111111〇 1/1 N a 2H P O 4, 16 m m o l / L K H 2P O 4 o 室温避光储存。用之前稀释至I X ，并调 p H 至 7. 4。 2. 0 . 7 5 % 琼脂糖： 750 m g 的低熔点琼脂糖（ L M P ) ， I X P B S (无 Ca2+和 M g 2+)。在搅拌盘上中火/高火加热揽拌，分装 I. 〇 m L 入 I.5m L Eppendorf管。储存于 4°C 。在实验当天将含琼脂糖的Eppendorf管放在微波炉内高火加热10X 20 s，然后置于42°C 加热器或水浴。 3. 1.0%琼脂糖： 1_ O g 的琼脂糖（ N M P ) ， I O O m L l X P B S (无Ca2+ 和 M g 2+ ) 。在搅拌盘上中火/高火加热搅拌，分取 4.0 m L 人 Falcon管。储存于4°C 。在实验当天将含琼脂糖的Eppendorf管放在微波炉内高火加热10X 20 s, 然后置于 42°C 加热器或水浴。 4 . 裂解缓冲液（见注释 4): 2 .5m ol/L N aC l， 100m m ol/L 乙二胺四乙酸四钠盐 (tetrasodiumEDTA)， lO m m ol/L T ris 碱， 1% 十二焼基肌氨酸納（ n-lauryl sarcosine)。振荡以消除块状物。缓慢加人I L 双蒸水并在搅拌器上搅拌。用 NaOH或 H C l调节 p H 至 10_0。室温避光保存。实验当天在使用缓冲液前 30min加人 l% Trit〇n X -100至预设体积，放在 4°C (见下文）。 5•电泳缓冲液A (见注释5): 0.3 m 〇V L N a O H ， 1 0 m m o l /L 乙二胺四乙酸四钠盐， 0.1% 8-羟基喹啉， 2 % D M S O 。缓慢加入双蒸水并在搅拌器上搅拌。一边混勻一边加入D M S O 。用 N a O H 或 H C l 在酸度计上调整p H 至 13. 1±〇. 1。在实验当天配制。 6 . 中性缓冲液： I mol/L 乙酸铵（a m m o n i u m acetate)。用 N a O H 或 H C l 调节 p H 至 7.0。 7•双重染色测细胞活性：萸光素二乙酸醋储液（fluorescein diacetate， 5.0 m g / m l 丙酮）， E B 储液（200 fxg/m L 无 Ca2+ 和 M g 2+ 的 P B S )，调整 p H 至 7. 4。将荧光素二乙酸酯储液置于一20°C ; E B 用铝箔纸包裹后置于4°C 。作为工作液，将储液混在 Eppendorf管中： I.2 m L 无锦镁 P B S , 7. 5 fxL突光素二乙酸以及50 •136 • fzLEB。现配现用。 8. D N A 染色：取 5.0 斗的 S Y B R Gold 染料（M〇 lecular Pr〇 bes 加 . n〇. ^ 11494)加入 50 m L 超纯水。用锡箔纸包裹， 4。〇避光保存$

1.2 玻璃器具和实验器材

（1）移液器。

（2）吸头（10、 20、 100、 200、 1000 uL)。

（3）刻度烧瓶（100 m L 、 500m L 和 I L )。

（4）量筒（100 m L 、 500 m L 和 1L )。

（5）烧杯（250 m L 、 500 m L 和 1L )。

（6）培养皿（120 m m 直径）。

（7）洗瓶（用于超纯水）。

（8）冰盒。

（9）冻存管（1.0 m L )

（10）Eppendorf 管（0 •5 m L 、 I.5 m L )。

（11）带旋盖的离心管（50 m L )。

（12）塑料/玻璃盘（如吸头容器的盖子或底盘)。

（13）显微镜用载玻片。

（14）显微镜用盖玻片。

1.3 仪器

（1）p H 计。

（2）分析天平。

（3）磁力搅拌器和搅拌棒。

（4）电源，以提供低电压和高电流（如 300 V ， 2000 m A )。

（5）水平电泳仪。

（6）慑子。

（7）剪子。

（8）Gelbond 胶（琼脂糖凝胶支持介质）（Mandel cat. no. 53740 G B 1638)。

（9）L a b T e k I[小室（NalgeNunccat. no. 154461-B )。

（10）加热器或者水浴锅。

（11）有彗星图像分析软件的计算机（Kinetic Komet 5. 5 或其他）。

（12）带有40倍油镜的突光显微镜（Zeiss AxioPlan U 或其他）和合适的激发/发射

滤光片（如 S Y B R Gold: 激发光300n m ，发射光495/537 n m ，染核酸）

二、方法

1. 校准

彗星实验的校准可通过评判经电离辐射（X 射线或 γ 射线）或化学处理（过氧化氢、环磷酰胺或M M S ) 后引起的细胞D N A 损伤得以进行（见注释7) (I, 4, 5)。做一条剂量效应曲线以判断此项技术的敏感性（图 2)。每次使用新物种和不同细胞系都需进行校准。有些实验室通过同时进行阳性对照（如放射或化学处理）来确保每次彗星实验的一致性
将田鼠（ Mfcroiw^ enns; yZmm_ CMS) 全血暴露于137C s放射后的剂量反应曲线。 N= 4 。注意尾长（ tail length) 对应于剂量的平台期，尾矩 (tail moment) 对应于剂量的指数增长趋势。

2. 细胞活性

凋亡或坏死的细胞并不表现出典型的彗星图像。相反，它们的头部很小或根本没有而彗尾则大且弥散（图 3 ) 这些细胞常被称作泪滴状细胞、鬼影细胞或刺猬细胞（1，4)。这类细胞能通过细胞毒物和（或）非遗传毒物诱导产生，应该在分析时被排除。细胞暴露于遗传毒物也会出现这种类型的图像，此时则应纳人数据分析。因此，需要对细胞悬液进行细胞毒性的同期测定以确定细胞严重受损的原因以及这些细胞是否应被归人数据分析。
细胞活性的检测首选以下两种方法之一。第一种是用双重染色活性实验（6)。在这个实验中，将等体积的细胞悬液和E B /突光素二乙酸酯工作液（见 2 . 1 中 7 ) 混合，然后滴在血细胞计数板的两边（10 fxL)。不论死细胞还是活细胞都将同时通过荧光显微镜计数。有代谢能力的细胞（活细胞）通过细胞酯酶将荧光素二乙酸酯转化成代谢焚光素
从而显现绿色荧光；而没有代谢能力的细胞（死细胞）因为细胞膜通透性改变， D N A被溴化乙锭染色从而显现红色。另一种方法是用台盼蓝排除实验法。在这个实验中，将等体积的细胞悬液和台盼蓝溶液相混合，分别滴在血细胞计数板的两边（I O m L ) , 通过普通显微镜在一定时间内计数死细胞及活细胞（通常在 2〜5m i n 内）。着色的细胞没有
活性，而无色透明的细胞则为活细胞。一般而言，样本中阴性对照中活细胞比例在7 0 % 〜7 5 % 以下的不应进行后续分析。在 I.5 V 'em 电泳20 m in后观察到的对照（ a)、损伤（ b)、中度损伤（ c) 和凋亡或高度损伤的细胞核（ d)。细胞用SYBR Gold进行DNA染色。

3. 种属差异

前提是活细胞的情况下彗星实验能在几乎所有有核细胞中进行。但在某些种属的细胞（如鸟类）中，全血不适于彗星实验，因为超过 8 0 % 的细胞表现为「鬼影细胞」或「刺猬细胞」，有可能是由于降解和有核成熟红细胞中功能惰性的 D N A /R N A 。此种情况下，白细胞需从有核红细胞中分离才能进行彗星实验。两栖类的全血细胞则无此现象。

4. 评判损伤的标准

为了量化D N A 损伤，胶染色（如 E B 、 S Y B R Gold、 S Y B R G r e e n ) 后在荧光显微镜下观察 D N A 的迁移，通过合适的软件包如 K o m e t 5. 5 (Kinetic Imaging, Nottingh a m , U K ), C o m e t Assay F (Perceptive Instruments， Suffolk, U K ) 给彗星打分。受损细胞会呈现出类似星空中彗星的图像，有一条含 D N A 的长尾巴从受损细胞的核中央迁移出去。损伤程度主要运用到三个重要值：彗尾长度、尾矩（彗尾长度与彗尾中D N A 的百分比乘积）或 Oliv e 尾距（彗尾重心到彗星头部中心位置的距离乘以D N A 在彗尾中的百分含量）以及尾部D N A 的百分比含量（7, 8)。由于不同的图像分析软件用不同的方法计算这些指标，因而哪个指标最有效目前尚未定论。
当暴露于低剂量的遗传毒性物质时，尾长会随之迅速增加，但是在较高浓度时，尾长的变化会到达一个平台（9)。然而在彗尾区域D N A 的含量能够随着毒物剂量的增加而持续增加，理论上从〇〜100% (7)。所以，随着剂量的增加，彗尾密度持续增加而不是尾长增加（图 2)。由于尾矩是基于长度计算的，因此有人认为彗尾密度或者彗尾D N A 百分含量应作为最好的衡量遗传毒性的标准。

5. 冻存样本

当彗星实验不能在样本收集后立即进行，样本可以在液氮中冻存直至合适的时间，前提是它们放置在合适的细胞冻存液中（11-13)。我们发现对于血液样本，无钙镁 PBS加上 10% DMSO或者无钙镁 PB S加上 1 0 % DMSO和 20 m m o l Z L EDTA ( 1 2 ) 可以作为合适的细胞冻存液。样本需要在室温下水浴解冻，并且立即进行后续实验。但是由解冻样本所进行的彗星实验得来的数据不能直接与非解冻样本所得的数据进行比较，因为解冻过程会提高D N A 迁移的背景值。因此，对照试验也应当控制在相同条件下（冷

冻）。

6. Gelbond胶碱性彗星实验

1. 将含有0.75%低熔点琼脂糖胶的1.5 m L Eppendorf管微波炉高火加热1〇〜 20 S0 2. 融解后，将离心管放在42°C 加热器或水浴锅中预热。 3•将Lab-TekII小室压30 s 固定在Gelbond上。 4.后续步骤需在较暗的灯光下进行。 5•取30 稀释到合适比例的细胞悬液加入到270 融化的琼脂胶中。轻轻用移液器混匀（见注释9)。 6•取120 ^ x L 细胞-琼脂糖胶悬液加人两孔小室中的一孔。 7•取120ML 细胞-琼脂糖胶悬液加入另一个固定在其他Gelbond胶上的小室。重复步骤 5〜6。 8. 需要同时做阴性对照。 9. 一旦琼脂糖胶凝固，小心移走 Lab-TekII小室，并将各自Gelbond胶放人一个装满 75 m L 裂解液的塑料盒中。 10. 4°C 放置过夜。 11•第二天校准p H 计。 12. 制备新鲜的电泳液。 13. 将胶从冰箱/孵箱/水浴锅中取出。 14•把培养皿放入水槽中并加入干净的水。让水缓慢流人盘中。 15.用镊子将Gelbond胶从裂解液中移出，反复浸入培养皿大约30s, 或者直到裂解液的泡沫消失（见注释1 1 和 12)。 16•将Gelbond胶放入电泳仪，倒入电泳液至水平液面高于胶面I c m (见注释 13)。让胶在电泳液中平衡30min。 17. 30m i n 后，衡压条件下进行电泳（时间和电压需要根据样本类型调整，见注释 3)。 18. 把培养皿放人水槽中并加人干净的水。让水缓慢流人盘中。 I9•用镊子将Gelbond胶从电泳仪中移出，反复浸人培养皿大约30s, 或者直到电泳液流光。 20. 将 Gelbond胶转移到另一个装有75 m L 中和液的盘中，平衡 30min。 21. 30min 后将胶按上述方法漂洗，然后把胶放在75 m L 8 5 % 乙醇中至少2h 。 22. 取出胶，过夜晾干。 23•用标记好的信封储藏风干的胶。 2 1 在 50 m L 管中配制S Y B R Gold溶液（见 2.2 中 10)，并在另一 50 m L 管中装水，以备染胶。 25•将其中一个Gelbond胶切成小条，每个小条中含有两个样本。 26.标记并染色（见注释14)

27. 染色后，用慑子移走Gelbond小条，并将其浸没水中两三次。 28. 胶面向上，将胶放在载玻片上，并盖上22_ X 50 _ 盖玻片。 29. 用纸巾轻压盖玻片以除去多余水分并形成密封。 30. 在盖玻片上滴加一滴甘油，然后在显微镜下观察。用合适的软件统计每个玻片上最少50个细胞。

7. 其他与环境毒理学相关的彗星实验技术

三种由普通的碱性彗星实验改良而来的方法也可作为研究环境毒理学和基因组学的有力工具。首先，彗星实验可与荧光原位杂交技术（F IS H )结合以确定D N A 断裂发生在基因的哪个区域（14, 15)。第二种方法，彗星-DNA弥散实验，通过在彗星实验中不经电泳而用乙醇沉淀D N A , 来区分细胞死亡的类型[如凋亡（细胞程序性死亡)]和坏死（在损伤或疾病中死亡的细胞）（16)。此外，也可通过在中性缓冲液而非碱性缓冲液中进行彗星实验来检测DNA双连断裂（5, 17)。这项技术也能评价生殖细胞中的D NA 损伤，这种损伤通常有高水平的碱性不稳定位点（5, 18, 19)(见注释6)。

注意事项

1 . 由于彗星实验的基本原理是检测单个细胞的D N A 损伤（通常不少于5 0 个细胞），所以胶内细胞密度不宜过髙；否则细胞影像可能重叠，从而导致后续测量无法进行。通常将细胞样本稀释至2X105〜4X105/m L 即可。例如，哺乳类全血需用无钙镁P B S 按 I : 10稀释而两栖类全血则需稀释至1 : 100。 2. 在中性p H 条件下，只有 D N A 双链断裂能被彗星实验检测到（17)。在碱性条件下（ p H >13.1)，双链、单链断裂以及碱性不稳定位点（在碱性条件下表现为单链断裂）都能被检测到（1， 4)。与辐射暴露相比，化学遗传毒物引起的双链断裂要比单链断裂低若干数量级（1)。因此，碱性彗星实验在生物检测领域比中性彗星实验更有用。然而，在有些情况下，细胞（如精子）可能本身就有高水平的碱性不稳定位点（18)。此时不宜用碱性缓冲液，因为这些位点会在碱性条件下表现为D N A 单链断裂。因此阴性对照液表现出较强的D N A 损伤。在这些情况下，推荐使用中性缓冲液（ Tris-乙酸 E D T A 或者 Tris-硼酸 E D T A ; p H 7〜8)。有些研究者用p H 9.0 (20)和 12. 5 ( 2 1) 的电泳液，也没有导致 D N A 损伤的增加。 3. 如果在电泳时电压过低和电泳时间过短， D N A 就不能从彗星头部迁移。相反，如果电泳时电压过高和电泳时间过长，未受损细胞中的D N A 也会大面积迁移。因此需要优化条件使得只有损伤才能被探测到。通常 5 % 〜1 0 % 的阴性对照会出现彗尾，并且彗尾的长度不超过15〜Z O fZm (10)。合适的电压和电泳时间应根据被测细胞的种属、类型，使用的设备，所需电泳缓冲液漫过胶面的体积来调整。电泳电压（衡压）需用 V /c m 表示，由电泳电压除以电泳仪阳极至阴极的距离决定。对于血液样本初始条件以1.5 V /c m ， 16〜20m i n 为宜。需在实验开始前优化条件，并保证在实验过程中此条件严格不变

4.这种裂解缓冲液对大多数细胞都适用，但对生殖细胞需要一种特殊的裂解缓冲液使核暴露。对这些细胞，裂解液成分如下： 2.5 mol/L NaCl (146.1 g/L ), 100 m m o l / L 乙二胺四乙酸四钠（41_ 6 g/L )， 10. 0 m m o l / L Tris-H C l (0•61 g/L )。缓慢加人I L 纯净水并用搅拌器搅拌。用 N a O H 或 H C l 调节 p H 至 10. 0。 21°C避光储存。在实验当天，加人 1 % 的 Triton X -100和 4 m m o l / L D T T 至所需体积并混匀。不要冷藏。约 I h 后，倒出缓冲液加入含有0.1 m g / m L 蛋白酶 K 的新鲜缓冲液， 37°C过夜。加入 D T T 和蛋白酶K 的目的是浓缩生殖细胞的染色质。 5•这个电泳缓冲液的配方适用于标准的碱性彗星实验。生殖细胞本身有非常多的碱性不稳定位点（18)，需使用中性缓冲液。在仅需检测D N A 双链断裂的情况下需要使用中性缓冲液。 Tris-乙酸 E D T A 或 Tris-硼酸 E D T A (p H 7〜8 ) 缓冲液适用于这些情况。 6 . 当染色强度减弱时，可以向溶液内补充5 ML S Y B R Gold。但是此种补充方法只能用一次，之后需要新配染料。用活性炭处理废弃染料。 7. 对于生殖细胞，由于其染色质很紧凑，在暴露于化学药物（如双氧水）前需要先将其进行裂解。但是对于体外辐射暴露，细胞并不需要经过事先裂解。 8. 新的小室底部有黏性，但是随着使用次数的增加黏性会减弱。可以通过在小室底部加入1 % 琼脂糖溶液来重复利用旧的小室。轻轻用戴手套的手指蘸取1 % 琼脂糖涂在Lab-TeklI小室的底部，将其附在G e l b o n d胶上，使之凝固。琼脂糖使小室得以密封，样本可如前所述加人其中。 9. 如果用的是冷冻样本：将样本从一80°C 冰箱取出，放在室温水浴。一旦样本融解（约 1〜3min)，轻轻混合，放在冰上。 10. 如果条件允许，使用对照。如果没有对照，可用人指血（稀释： 20 fxL人血与 180 无耗镁P B S 混合）做为替代物。阴性样本可以事先冻存并且在需要的时候融解。但是这些样本的活性和D N A 损伤需要经常检测因为随冷冻时间延长， D N A 损伤会增加。 11. 胶中残留的裂解液中的盐成分会使电泳时彗星的形态发生变化，因此样本需要适当漂洗。 12•对某些特殊类型的D N A 损伤（如 D N A -蛋白质交联和几种氧化碱基损伤）的研究者会加人D N A 特异内切酶（如核酸内切酶M ) 或蛋白酶进行第二步裂解。这些酶会识别并且试图修复某些类型的D N A 修饰。然而，这些修复复合物不稳定，当胶暴露在碱性环境中这些修复位点会降解产生D N A 单链断裂。在这些酶存在的条件下D N A 损伤的程度会比阴性对照增加，表示有能被所加的酶识别的D N A 特异性损伤存在（10)。 13•由于可用不同模型的水平电泳仪，而这些仪器的尺寸又不尽相同，因此需要调节合适的电泳缓冲液体积。通常电泳液需漫过胶面l c m 。保证电泳仪内电泳液体积的一致性和准确性非常重要，因为不同体积会导致引起D N A 迁移的电场力强度不同从而导致结果的不一致。这在使用一台以上的电泳仪的情况下，对于实验中匹配的样本更加重要。 14.当使用哺乳动物和鸟类的白细胞及哺乳动物的精细胞时，染色 10〜15m m 。两

栖类全血细胞需染色约30 min

来源：丁香实验