免疫组化双染实验操作步骤
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第一抗体的染色:
1、 将切片浸在3%H2O2甲醇溶液(新鲜配制)中10分钟,PBS 冲洗2分钟×3次
2、 加100ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上,室温孵育10分钟,倒掉(不能冲洗)
3、 加入一抗(按照说明推荐浓度和孵育条件)
4、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS),冲洗2分钟×3次
5、 加入100ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2),室温孵育10分钟
6、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次
7、 加入100ul(2滴)链霉亲和素-AP(试剂3)的二抗,室温孵育10分钟
8、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次
9、 准备底物溶液:将1滴试剂4A和4B加入到1ml去离子水 中,充分混匀;再加入1滴试剂4C,充分混匀
10、 加100ul(2滴)配好的AP底物溶液,室温孵育(镜下检测孵育时间)
11、 使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应
第二抗体的染色:
12、 加100ul(2滴)双染增强剂(试剂7),孵育
13、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS),冲洗2分钟×3次
14、 加100ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上,室温孵育10分钟,倒掉(不能冲洗)
15、 加入稀释好的一抗(按照说明推荐浓度和孵育条件)
16、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS),冲洗2分钟×3次
17、 加入100ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2),室温孵育10分钟
18、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次
19、 加入100ul(2滴)链霉亲和素-HRP(试剂5)的二抗,室温孵育10分钟
20、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次
21、 准备底物溶液:将1滴试剂6A和6B加入到1ml去离子水中,充分混匀;再加入1滴试剂6C,充分混匀:
22、 加100ul(2滴)配好的HRP底物溶液,室温孵育(镜下检测孵育时间)
23、 使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应
24、 使用复染试剂染色(根据需要选择)
25、 封片剂(试剂8)封片,显微镜观察结果 免疫学 免疫组织化学