α 突触核蛋白超声处理实验操作步骤（适用于 tau, Aβ 等其他活性蛋白）

材料：超声管

仪器：通风橱、非接触式超声波破碎仪或探头超声波仪（带 1/8”尖端的超声仪）

超声前后准备 PFF 的步骤：

1. 收到原纤维后，立即将它们储存在 -80℃。

2. 提前计划好需要尝试的超声处理设置和原纤维的量以便实验顺利进行。

3. 37℃ 下解冻超声实验所需的原纤维的量。

4. 分装到多个超声管中，并按之前计划好的在不同的时间和设置下对它们进行超声处理。

5. 通过电镜（EM） 查看上述经过超声处理的样品，寻找纤维尺寸分布为 ~50nm 的样品，记录为最佳超声处理设置。

6. 解冻未超声处理的原纤维（收到后储存在 -80℃ 的原纤维）。

7. 在开始实验之前在最佳超声处理设置下进行超声处理（为达到最好实验效果，我们建议是在进行超声处理后立即使用，但如果工作流程不允许，替代方法是：在最佳超声处理设置下进行超声处理，等分到所需剂量（体积) ，冷冻等分试样以备后用。然后他们可以在注射前根据需要解冻超声处理的等分试样）。

非接触式超声波破碎仪操作设置:

使用 1.5mL 微量管（Microtubes）加盖，至少 100uL 样本体积（建议 100-300uL），30 秒开, 30 秒停, 5 个高频循环。（注：仪器频率/功率范围为 20-60kHz 和 25-210 瓦。） 

我们建议在较高浓度下进行超声处理，然后再进行稀释。超声处理会增加材料的溶解度和均匀性，因此超声处理之后再移液和稀释会更准确。

由于实验环境还有仪器的不同，并没有一个一劳永逸的黄金法则，最好的选择是使用您现有的超声仪根据您的实验需求优化超声处理方案。可以通过沉降分析寻找大部分原纤维变得可溶的超声参数，或使用 AFM/TEM 确定原纤维长度 <50nm 的超声参数。

探头超声波仪操作步骤（改良自 Michael J Fox 机构）

在通风橱或生物安全柜中执行所有超声处理的步骤。确保通风柜采用外部管道，不会将废气再循环到实验室内。

1.在 37℃ 下解冻足量的 5mg/mL PFF 然后立即使用。建议再次测量蛋白质浓度，因为冻融可能会改变蛋白质浓度。

2.将 PFF 添加到含有适当体积的无菌 dPBS 的无菌微量离心管中，将 PFF 稀释至所需浓度。（注：对于小鼠注射，我们通常使用 2-2.5mg/mL 的 PFF。）

3.使用探针超声仪，以 2 档功率超声处理总共 60 个脉冲（每次约 0.5 秒）。在每 10-12 个脉冲之间暂停一下，以防止溶液过度加热并避免起泡。

我们还使用高能水浴超声波仪测试了该操作步骤，到目前为止的结果表明该步骤也适用于对 PFF 进行超声处理。水浴超声波仪可以对封闭管进行超声处理，对于这种可能生成危险气溶胶的操作比较安全。然而，当使用浴式超声处理代替探头超声处理时，同样需要确认原纤维在 ≤ 50nm 的长度，以达到合适的毒性。