α突触核蛋白活体建模及其他活性测试
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简介
α突触核蛋白活体建模及其他活性测试
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操作方法
此方法描述了一般AFM 样品制备和成像。具体参数可能因成像的蛋白质样本及其缓冲液成分而异。1. 1-5mg/mL 的蛋白质样品在过滤消毒的 dH2O 的中稀释 1/10 至 1/100 然后将 20uL 滴到新鲜切割的云母上（12mm，V1）。样品在室温下孵育 10-20 分钟。注：有些样品不容易粘在云母上；在这种情况下，用 0.1% 聚-L-赖氨酸预处理新鲜切割的云母，用过滤消毒的 dH2O 洗
α 突触核蛋白沉降试验操作步骤1. 将 40μL 的 PFF 移入微量离心管中（最好是螺帽管）。2. 最大速度离心 60 分钟。3. 小心将上清液 (40μL) 转移到新管中。添加 10μL 的 5X Laemmli 缓冲液并标记为「上清液」。4. 将沉淀悬浮于 40μL PBS 中，再次最大速度离心 30 分钟。保存上清液并标记为 「洗涤」 。5. 将沉淀物悬浮在 40μL PBS 中并标记为 「沉淀物」 ，向该部分添加 1
α 突触核蛋白活体注射建模实验操作步骤大鼠蛋白注射步骤2 uL PFFs 或者单体 (阴性对照) 通过以下两个脑顶叶区的位置注射（每个注射位点 2uL）:AP + 1.6, ML + 2.4, DV - 4.2 从头骨AP - 1.4, ML + 0.2, DV - 2.8 从头骨30 天后, 用生理盐水灌注大鼠，然后将大鼠脑由冠状平面切开，将中脑与前脑分开。之后两部分都用 4% PFA 固定 48 小时.DAB 操作步骤第一天: (
Tau 蛋白硫磺素T检测操作步骤1.在蒸馏水中制备 1mM 的硫黄素 T 储备液 (需是新鲜制备并用 2µm 注射式过滤器过滤)。2.然后用 PBS pH7.4 将每个孔中的硫黄素 T 储备液稀释至最终浓度为 25µM (每孔容量 = 100µL)。3.向每个孔中加入 10uM 肝素。4.将分装小份的 tau 蛋白在使用前于 37℃ 下进行解冻。5.将原纤维或单体 (或两者都有) 加入到合适的实验孔中. 用移液器上下吸放混合孔中
α 突触核蛋白操作指南储存条件：单体, 寡聚体, 和未经超声处理的原纤维和纤丝: -80ºC; 保质期一年以上超声处理过的原纤维: -80ºC; 8 周冻融循环：最多 2 次冻融循环解冻条件：原纤维, 寡聚体, 和纤丝: 37ºC单体: 置于冰上或 4ºC储存条件 (解冻的蛋白)：原纤维, 寡聚体, 和纤丝: 室温. 不要将原纤维保存在冰上或者 4ºC; 原纤维和纤丝在 4ºC 下不稳定并会很快降解. 原纤维, 寡聚体
α 突触核蛋白超声处理实验操作步骤（适用于 tau, Aβ 等其他活性蛋白）超声前后准备 PFF 的步骤：1. 收到原纤维后，立即将它们储存在 -80℃。2. 提前计划好需要尝试的超声处理设置和原纤维的量以便实验顺利进行。3. 37℃ 下解冻超声实验所需的原纤维的量。4. 分装到多个超声管中，并按之前计划好的在不同的时间和设置下对它们进行超声处理。5. 通过电镜（EM） 查看上述经过超声处理的样品，寻找纤维尺寸分布为 ~50nm 的样品，记录为最佳超声处理设置。6. 解冻
α 突触核蛋白透射电子显微镜（TEM）实验操作步骤（适用于 tau, Aβ 等其他活性蛋白）1. 解冻样品，样品浓度 1mg/mL。2. 将 10ul 样品加到碳膜网格上，1 分钟后用滤纸去除多余的液体。3. 加 10μl dH2O 于网格上，用滤纸去除多余的液体.4. 将 10ul 的 2% 乙酸双氧铀涂到网格上，30 秒后用滤纸去除多余的液体。5. 将另外 10ul 的 2% 乙酸双氧铀涂到网格上，1 分钟后用滤纸去除多余的液体。6. 让网格风干几分钟，然后将其存放在网格盒中。7.
Tau 蛋白操作指南储存条件：单体, 未经超声处理的原纤维和纤丝: -80ºC; 保质期一年以上超声处理过的原纤维:-80ºC; 8 周冻融循环：最多 2 次冻融循环解冻条件：原纤维和纤丝: 37ºC单体: 置于冰上或 4ºC储存条件 (解冻的蛋白)：原纤维和纤丝: 室温. 不要将原纤维和纤丝保存在冰上或者 4ºC; 原纤维和纤丝在 4ºC 下不稳定并会很快降解. 原纤维和纤丝在室温下稳定，在准备实验时可以放在试验台
α 突触核蛋白硫磺素T检测操作步骤1. 用蒸馏水制备 1mM 硫黄素T 储备溶液 (新鲜制备并使用 2μm 注射器过滤器过滤)。2. 用 PBS pH7.4 稀释硫黄素T，确保每个孔中的硫黄素T最终浓度为 25μM (每孔溶液体积= 100μL). 孔板: 96 多孔孔板.3. 在将要使用之前才把 alpha 突触核蛋白小份在室温下解冻。4. 在相应的孔中加入 10μM 前体原纤维或者 100μM 单体 (或两者都有). 用移液器
