免疫组化双染实验操作步骤

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第一抗体的染色：

1、 将切片浸在3%H2O2甲醇溶液(新鲜配制)中10分钟，PBS 冲洗2分钟×3次

2、 加100ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上，室温孵育10分钟，倒掉(不能冲洗)

3、 加入一抗(按照说明推荐浓度和孵育条件)

4、 使用含有0.05%吐温20的PBS ( TPBS)，冲洗2分钟×3次

5、 加入100ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2)，室温孵育10分钟

6、 使用含有0.05%吐温20的PBS ( TPBS)冲洗2分钟×3次

7、 加入100ul(2滴)链霉亲和素-AP(试剂3)的二抗，室温孵育10分钟

8、 使用含有0.05%吐温20的PBS ( TPBS)冲洗2分钟×3次

9、 准备底物溶液：将1滴试剂4A和4B加入到1ml去离子水 中，充分混匀;再加入1滴试剂4C，充分混匀

10、 加100ul(2滴)配好的AP底物溶液，室温孵育(镜下检测孵育时间)

11、 使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应

第二抗体的染色：

12、 加100ul(2滴)双染增强剂(试剂7)，孵育

13、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)，冲洗2分钟×3次

14、 加100ul(2滴)血清封闭溶液(试剂1)到切片上，室温孵育10分钟，倒掉(不能冲洗)

15、 加入稀释好的一抗(按照说明推荐浓度和孵育条件)

16、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)，冲洗2分钟×3次

17、 加入100ul(2滴)生物素化的二抗(试剂2)，室温孵育10分钟

18、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次

19、 加入100ul(2滴)链霉亲和素-HRP(试剂5)的二抗，室温孵育10分钟

20、 使用含有0.05%吐温20的PBS( TPBS)冲洗2分钟×3次

21、 准备底物溶液：将1滴试剂6A和6B加入到1ml去离子水中，充分混匀;再加入1滴试剂6C，充分混匀：

22、 加100ul(2滴)配好的HRP底物溶液，室温孵育(镜下检测孵育时间)

23、 使用含有0.05%吐温20的去离子水冲洗终止反应

24、 使用复染试剂染色(根据需要选择)

25、 封片剂(试剂8)封片，显微镜观察结果 免疫学免疫组织化学