求助，plko.1酶切条带很奇怪
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用plko.1构建敲降质粒，双酶切时用的是BshT1和EcoR1，按理说切出来的电泳后应该一条7k bp一条1.9k bp,但做了3次都没有1.9k bp的条带，却都有一条接近3k bp的条带。
酶没有问题，3次酶切时间也不一样，都切开了，用了3管不同的plko.1质粒,其中2管来自同一菌液，另1管来自不同的菌液，质粒不是同一人提的，按理说应该也可以排除质粒本身的问题，问过师姐都说可以去用，但拿去做完转化后送去测序都没信号，从头到尾整个实验就是这个酶切条带实在无法理解，想问问这是什么情况。
2 个回答
loveliufudan
以下是一些可能的解释：
酶切位点：请确保BshT1和EcoR1的酶切位点是正确的。如果酶切位点存在问题，可能导致不完整的酶切或完全没有酶切。您可以查看质粒的序列，或使用其他方法（如限制性内切酶消化或测序）来验证酶切位点是否正确。
酶切反应条件：请确保使用的酶切反应缓冲液、酶的浓度和反应时间都是正确的。有时候，过高或过低的浓度、反应时间不足或过长，可能导致不完全的酶切或者不正确的酶切。
质粒问题：即使来自不同的菌液，质粒也可能存在变异或不正确的构建。如果这些质粒存在问题，可能会影响您的酶切结果。
DNA片段太小：如果您的DNA片段太小，可能难以在电泳中看到正确的条带。您可以尝试使用聚丙烯酰胺凝胶（PA gel）或聚丙烯酰胺凝胶梯度凝胶（PAGE）进行电泳分离。
转化问题：转化后未检测到您所期望的DNA序列可能是由于转化效率不高，或者您的DNA不稳定，损失了在过程中。您可以尝试使用其他方法（如电转化或者化学转化）来提高转化效率，或者使用其他方法（如PCR）检测您的DNA样品是否稳定。
毛利小五郎的徒弟
还是酶的问题，酶没有把最后一个化学键切开，建议重新确定化学键序列然后选择合适的酶
