酶切法

在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。

1. 取10 μl DNA于0.8% 凝胶检测；

2. 将DNA调节浓度至300-400 ng/μl ；

3. 仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书，熟悉反应条件及酶切的贮存浓度（10U-50 U/μl）厂家配套试剂；

4. 计算据反应条件所需要的各种试剂准确用量：（0.5 ml tube中）
DNA(3-5 mM) 10 μl
buffer reaction ´10 1.5 μl
Enzyme (15 U/μl) 0.8 μl（冰上）
ddH₂O 2.7 μl
混匀，短暂离心；

5. 37 ℃ 温浴1-2 hrs (纯DNA) 或10 hrs（粗制DNA）；

6. 加入上样缓冲液终止酶切反应，也可65 ℃加热10 min使酶变性失活；

7. 电泳检测酶切效率：
每个样品取1/10量用琼脂糖电泳检测，制胶及点样方法同上。

1.酶解不一定要过夜,不过反应时间越长所用的酶量就越少。与用酶解鉴定载体/插

入片段相比,酶解基因组DNA所用酶浓度要高一些,一般1μg基因组DNA需加入5U内切酶。

2.若电泳条带靠近加样孔的一端比另一端亮得多,表明酶切不完全。这可能是因为:①反应时间不够长(若反应过夜则可排除此项);②酶量不够或酶部分失活;③如果初始DNA样品溶于TE缓冲液中且在酶解反应中所占的体积较大时,TE缓冲液中的EDTA可能抑制酶解反应,这时可以用乙醇重新沉淀DNA,然后溶于少量TE缓冲液或SWD中。

3.选用的DNA相对分子质量其涵盖的相对分子质量范围要大,如λHindⅢ可涵盖500bp到23kb的范围。

4.DNA样品经消化后在各泳道中条带的亮度应一致,否则表明各样品浓度不一致。DNA浓度通常难以精确测定,可以通过调节上样体积来调节DNA的上样量。