酵母遗传学方法4：质粒DNA的羟基突变

质粒 DNA 的羟基突变

 

1． 临用之前制备羟胺溶液，置冰上待用。

2． 将用氯化铯纯化的 10 μ g 质粒 DNA 加到含 500 μ l 羟胺溶液的微型离心管。

3． 在 37 ℃下培养 20 小时。

4． 加入 10 μ l 的 5mol/L NaCl 、 50 μ g 1mg/ml 的牛血清蛋白（ BSA ）和 1ml 无水乙醇终止反应，置－ 70 ℃沉淀 DNA10 分钟。

5． 离心 10 分钟，小心弃去所有上清液，收集 DNA 。

6． 将 DNA 悬浮于 100 μ l TE 缓冲液（ pH8 ）中，再加入 10 μ l 3mol/L 的醋酸钠和 250 μ l 的无水乙醇，在－ 70 ℃下放置 10 分钟，重复步骤 5 ，收集 DNA 。

7． 让沉淀自然干燥，再悬浮于 100 μ l TE 缓冲液（ pH8 ）。

8． 该 DNA 可直接用于大肠杆菌或酵母的转化。诱变 DNA 与非诱变 DNA 相比，酵母的转化频率相对降低约 3 倍。在大肠杆菌中， Ura ^－ 质粒可被检出。