质粒DNA的提取与纯化

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一 实验目的
　　1.掌握质粒 提取的原理及方法。
　　2.掌握琼脂 糖凝胶电泳的方法。

二 实验原理
　　根据共价闭合环状的质粒DNA与线性染色体 DNA片段之间在拓扑学上的差异发展起来的。在pH12-12.5时，线性DNA会完全变性，而共价闭合环状的DNA只是氢键断裂，酸中和后，共价闭合环状的DNA迅速准确地复性，而线性DNA聚合成网状结构，与变性的蛋白和RNA一道离心沉淀，上清液中的质粒DNA用乙醇沉淀出来。

三 实验步骤
　　已有许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：
　　1)细菌培养物的生长。
　　2)细菌的收获和裂解。
　　3)质粒DNA的纯化。
质粒DNA的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法。
1．碱裂解法：
　　（1）在5m1含相应抗生素的LB培养基中接种一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。
　　（2）将1.5m1培养物倒入Eppendorf管中，用微量离心机于4℃以12000rpm离心30秒。
　　（3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
　　（4）将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。
　　须使细菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触，按图1所示方法同时进行振荡，可使沉淀迅速分散。
　　　　
　　　　溶液Ⅰ
　　　　50mmol／L 葡萄糖
　　　　25mmol／L Tris·CI(pH 8．0)
　　　　10mmol／L EDTA(pH 8．0)。
　　　　在101bf／in2(6．895×104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。
　　（5）加200μl新配制的溶液Ⅱ．盖紧管口，快速颠 倒离心管，以混合内容物。将离心管放置于冰上。
　　（6）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ。盖紧管口，温和地振荡10秒钟使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3—5分钟。
　　（7）4℃ 12000rpm离心10分钟，将上清转移到另一离心管中。
　　（8）加等体积氯仿，振荡混匀， 4℃12000rpm离心10分种，将上清转移到另一离心管中。
　　（9）用2倍体积的无水乙醇沉淀双链DNA。温和振荡混匀，于-18℃放置20分钟。
　　（10）用微量离心机于4℃以12000rpm离心10分钟。
　　（11）弃上清，加入70%冷乙醇洗沉淀1-2次
　　（12） 真空干燥DNA沉淀后，将其溶于TE溶液中。

　　　　溶液Ⅱ（现用现配）
　　　　0.2mol／L NaOH
　　　　1％ SDS 　　　溶液Ⅲ
　　　5mol／L乙酸钾 60ml
　　　冰乙酸 11.5ml
　　　水 28.5ml