抗体的提取与纯化
互联网
精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术,避免蛋白变性。如分离IgG时,多结合使用盐析法与离子交换法,以求纯化。提取IgM的方法也很多,如应用凝胶过滤与制备电泳法,或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法
取x ml血清加x ml生理盐水,于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵,硫酸铵的终饱和度为50%。
↓4℃,3h以上,使其充分沉淀
离心(3000rpm),20min,充上清,以x ml生理盐水溶解沉淀,再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
↓置4℃3h以上,[此时,(NH4)2SO4的饱和度为33%]
重复上述第二步过程1~2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白,以0.02% mol/L pH7.4PBS溶解至x ml装入透析袋。
↓对PBS充分透析、换液3次,至萘氏
试剂
测透析外液无黄色,即无NH4+为止。
取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后,以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多,如蛋白质的浓度,盐的浓度,饱和度和pH,温度等都可影响盐析的结果,操作时要充分注意.
二、冷酒精沉淀法
分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水,调节 pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下,加预冷的酒精(-20℃)到最终浓度为20%,保持在-5℃。产生的沉淀(A),含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.15~20mol/L NaCl溶液(冷)中,加有0.05mol/L醋酸调节 pH到5.1,产生的沉淀(B),包括大部分的IgA和IgM,IgG留在上清液内。调节 上清液的pH到7.4,加冷酒精(-20℃~-30℃)到最终浓度为25%,维持在-5℃。所得到的沉淀(C)含有90%~98% IgG。不同动物,IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀(B)可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物:将沉淀(B)悬浮在0℃ 水中,调节 pH到5.1,离心去除不溶的蛋白。调节 上清液离子强度到0.01~0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%,保持在 –2℃或-3℃低温,所得的沉淀(B-B)主要含IgA和IgM。
表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件
<center> <table> <tbody> <tr> <td> <p class="tt1">物 种</p> </td> <td> <p class="tt1">pH</p> </td> <td> <p class="tt1">沉淀条件</p> </td> <td> <p class="tt1">IgG产量</p> </td> </tr> <tr> <td> <p class="tt1">酒精浓度(%)</p> </td> <td> <p class="tt1">离子强度</p> </td> </tr> <tr> <td> <p class="tt1">人</p> </td> <td> <p class="tt1">5.1</p> </td> <td> <p class="tt1">15</p> </td> <td> <p class="tt1">0.01</p> </td> <td> <p class="tt1">65</p> </td> </tr> <tr> <td> <p class="tt1">山羊</p> </td> <td> <p class="tt1">5.2</p> </td> <td> <p class="tt1">0</p> </td> <td> <p class="tt1">0.01</p> </td> <td> <p class="tt1">65</p> </td> </tr> <tr> <td> <p class="tt1">家兔</p> </td> <td> <p class="tt1">5.2</p> </td> <td> <p class="tt1">10</p> </td> <td> <p class="tt1">0.01</p> </td> <td> <p class="tt1">70</p> </td> </tr> <tr> <td> <p class="tt1">大鼠</p> </td> <td> <p class="tt1">5.0</p> </td> <td> <p class="tt1">15</p> </td> <td> <p class="tt1">0.01</p> </td> <td> <p class="tt1">50</p> </td> </tr> <tr> <td> <p class="tt1">豚鼠</p> </td> <td> <p class="tt1">5.1</p> </td> <td> <p class="tt1">15</p> </td> <td> <p class="tt1">0.01</p> </td> <td> <p class="tt1">70</p> </td> </tr> </tbody> </table> </center>
三、DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化免疫球蛋白
原理:DEAE-Sephadex A-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50)为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.85~7.5),其余均属酸性蛋白。PH7.2~7.4的环境中,酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通过柱层析,γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG.