材料与仪器
10 X 退火缓冲液 ATP 对叠氮化苯甲酰甲溴 生物素-11-dATP 生物素-11-dCTP 生物素-16-dUTP C18HPLC 溶剂 氯仿 调控毛细孔玻璃板(CPG)-寡核苷酸合成的支持物 dA dC dG Tβ-氰乙酸亚磷酸铵 dNTPs 变性上样缓冲液 DNA 聚合反应混合物 EDTA 洗脱液 乙醇
放射自显影标准物 放射自显影增感屏 烧杯 台式离心机 CHROMA SPIN+TE-10 和 SPIN+TE-100 旋转柱 DNA RNA合成仪 固定角度的小离心管 灭菌灯(254nm) HPLC 系统 增感屏 小离心管 寡聚核苷酸纯化试剂盒(OPC) 磷屏仪 多聚丙烯圆底管 解剖刀 Spin-X离心滤器 紫外分光光度计 真空干燥器 水浴或加热器
步骤
一、位点特异性生物素标记的 DNA 衍生片段的设计及预备
1.化学反应
2.酶反应
二、蛋白质-DNA 复合体的制备及紫外照射
1.轻轻摇动存储瓶,重悬顺磁性小磁珠。取出 3u1 的溶液转入一个硅化过的 1.5 ml 小离心管中,低速离心。
2.将管放入磁性粒子收集器中,静置 30s 后去掉上清。
3.用 30jullX 结合洗脱缓冲液,重悬磁珠,用一微量吸管轻轻混勻,室温孵育磁珠 2 min。
4.低速离心。
5.将管放人磁性粒子收集器中,静置 30s 后去上清,重复步骤③?⑤。
6.用 10ul 2X 结合洗脱缓冲液,重悬磁珠,加人 2ul 60nmol/L 生物素标记的位点特异性 DNA 片段衍生物(从本方案 7.1 中步骤48获得)。25℃ 孵育 10 min,不时轻轻敲打管子以混匀液体。
7.将管子放入磁性粒子收集器中,静置 30s 后,将上清转入一支新的硅化的 L5 ml 小离心管中。
8.通过比较磁珠和上清的放射量来估算生物素标记位点特异性 DNA 片段衍生物的结合产率,若结合产率大于或等于 80%,可继续以下操作,若产率未达要求,则需从本方案 7.1 中步骤25 开始重复操作。
要点:这一步及以后的操作步骤都需在暗光条件下完成。必须避免荧光和日光照射,可采用低等或中等的发热光源(如 60W 钨灯泡灯)。
9.用 30ul 1 X 结合洗脱缓冲液,重悬磁珠,低速离心。
10.将管放人磁性粒子收集器中,静置 30s 后去掉上清。
11.用 30ul l X 结合洗脱缓冲液,重悬磁珠,低速离心。
12.将管放人磁性粒子收集器中,静置 30s 后去掉上清。
13.用 1 X 蛋白质结合缓冲液重悬磁珠,使 DNA 达到预定浓度,加入预定浓度的蛋白质,在合适的温度下,经合适的时间孵育混合液,孵育过程中不时轻轻敲打管子侧壁,以使液体充分混匀。
在这一步及下面的操作中,DNA 和蛋白质的浓度、反应的温度和时间都根据以往的经验进行设定,或是根据已知的复合体内各组分相互作用的知识来确定。
14.低速离心。
15.将管放入磁性粒子收集器中,静置 10s 后弃上清。
16.用预先孵育到合适温度的 50ul 1 X 蛋白结合缓冲液,重悬磁珠,在合适的温度下孵育 2 min。
17.将管子放人磁性粒子收集器中,静置 30 s 后弃掉上清。
任选:在这一步里,可以加入增强子、抑制子或效应分子(见 Kim,etal,2000a;Naryshkin,etal,2000)。
18.用预先孵育到合适温度的 20ul 1 X 蛋白结合缓冲液重悬磁珠,将混合液转入一支聚苯乙烯小离心管中,而后将管子插人一支预先孵育到合适温度的 13mmX100mm 的硼硅酸玻璃培养管中。
19.将管子放人光化学反应发生器中,用紫外线照射蛋白质 DNA 样品 20s(11ml/mm2 于 350nm)。
如果所需的反应温度高于或低于周围环境的温度至少 10°C 的话,可在硼硅酸玻璃培养菅中注满 H2O, 而后对其进行预孵育,直至 H2O 的温度达到合适的温度为止。
20.将悬液转入一支硅化的 1.5 ml 小离心管中,加入 7ul 的终止反应溶液,振荡混匀。
21.将管放入磁性粒子收集器中,静置 10 s,取出 17ul 的上清,立即进行第三部分的操作。
三、核酸酶消化
四、发生交联反应的蛋白质的鉴定
来源:丁香实验