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方案7 位点特异性蛋白质-DNA 光交联法实验

相关实验:蛋白质复合体性质的研究

最新修订时间:

材料与仪器

DNA 聚合酶 I Klenow 片段 限制性内切酶A 和 B 单链 DNA 结合蛋白 单链 DNA 模板 T4 DNA 连接酶 T4 DNA 聚合酶 T4 多聚核苷酸激酶 T7 DNA 聚合酶 上游引物
10 X 退火缓冲液 ATP 对叠氮化苯甲酰甲溴 生物素-11-dATP 生物素-11-dCTP 生物素-16-dUTP C18HPLC 溶剂 氯仿 调控毛细孔玻璃板(CPG)-寡核苷酸合成的支持物 dA dC dG Tβ-氰乙酸亚磷酸铵 dNTPs 变性上样缓冲液 DNA 聚合反应混合物 EDTA 洗脱液 乙醇
放射自显影标准物 放射自显影增感屏 烧杯 台式离心机 CHROMA SPIN+TE-10 和 SPIN+TE-100 旋转柱 DNA RNA合成仪 固定角度的小离心管 灭菌灯(254nm) HPLC 系统 增感屏 小离心管 寡聚核苷酸纯化试剂盒(OPC) 磷屏仪 多聚丙烯圆底管 解剖刀 Spin-X离心滤器 紫外分光光度计 真空干燥器 水浴或加热器

步骤

一、位点特异性生物素标记的 DNA 衍生片段的设计及预备

1.化学反应




个则是与0 2 P 相应位置上的硫原子结合( 见 Fidanza, etal, 1992; Mayer andBarany, 1995K 根据寡聚脱氧核苷酸序列和H P L C 条件的不同,这两 个非对映异构体在洗脱中表现为一个单独的双峰( 如 在 溶 液 B 浓 度 为 2 4 % 和 2 5 % 处), 一 般不采取什么措施将这两个非对映异构体分离,因为在实 验中使用的就是两者的混合物,这样可同时探测到发生在 D N A 小沟中的 蛋白质-D N A 相 互 作 用 ( 由 O l P 衍生非对映异构体标记探测)和发生在 D N A 大沟中的蛋白质-D N A 相 互 作 用 ( 由 0 2 P 衍生非对映异构体标记探 测) ( L a g range,et al, 1996, 1998; K i m , et a

2.酶反应

用 12]ul H 2◦ 重 悬 5 p m o l 寡聚脱氧核苷酸衍生物,加入: 2沁 I O X 磷酸化缓冲液 5^1 [7 -32p ] A T P (I . 8 5 X 1 0 6B q, gp 50^Ci) Ijul ( I O U ) 的 T 4 多聚核苷酸激酶 37°C孵育 3 0 m in。 要点:这一步骤及以后的操作步骤,都需在暗光条件下完成。必须避 免 荧 光 和 日 光 照 射 ,可 采 用 低 等 或 中 等 的 发 热 光 源 ( 如 60W 钨灯 泡灯)。 ㉕ 加 入 2〇 W H 2◦ ,充分混匀。 @ 根据操作说明,用 C H R O M A S P I N + T E -lOspin柱 ,用 T E 对放射性标记的 .寡聚脱氧核苷酸衍生物脱盐,然后立即进行下一步操作。必要的话,可以将其在暗处 保存于一20°C ,但不能超过24h 。 ㉘ 在一支硅化过的I.5m l 小离心管中加入: 40沁放射性标记的寡聚脱氧核苷酸衍生物 1 4 1 0 y m o l/L 的上游引物 4pl 0 •5ymol/L 的单链D N A 模板 5沁 10X 退火缓冲液 65°C加热 5m in。 ⑳ 将 管 子 放 人 一 个 600m l 体积的烧杯中,内盛有400ml 65°C 的 H 2O , 在室温下 渐 渐 冷 却 ( 在 约 6〇 m i n 内 从 65°C 降 到 25°C )。 ⑩ 加 入 : 2 //1 D N A 聚 合 底 物 ( d A T P 、 d G T P 、 dCTP 和 dT T P 各 2 5m m ol/L ) Ijul 10 0m m o l/L A T P 0 .5 y l (IO U ) T7 D N A 聚合酶 Ipd (3 U ) T 4 D N A 聚合酶 lpd (5 U ) T4 D N A 连接酶 1^1 (l^g/m l) 单链结合蛋白 冰上孵育 5 m in , 然后在室温下孵育5 m i n ,接 着 在 37°C孵 育 lh。同时 做一个不加入连接酶的“ 无连接酶”平行对照
加 入 Ip l (5U ) T 4 D N A 连接酶, 37 °C 孵 育 2 h 。 © 加 人 1 0 1 0 % 的 S D S 终止反应。 ⑬ 根 据 使 用 说 明 操 作 C H R O M A S P I N + TE-IO spi n柱 ,用 T E 对产物进行 脱盐。 : . ⑭ 用限制性内切酶进行消化。 a. 如果限制性内切酶A 和 B 使用相同的缓冲液,则在桂化的1.5m l 聚 丙烯小离心管中加入: 从步骤⑳ 获得的56W D N A 衍生物/T E 溶液 6. 2沁 I O X 消化缓冲液 1M1 (I O U ) 的限制性内切酶A Ijul (I O U ) 的限制性内切酶B 37°C 孵 育 lh。同时做一个56W “ 无连接酶” 的限制性内切酶消化反应 的平行对照。 b. 如果限制性内切酶A 和 B 使用各自的缓冲液,且不能兼容,则在硅 化 的 I.5m l 聚丙烯小离心管中加人: 从步骤⑬ 获得的564 D N A 衍生物/T E 溶液 6. 2//1 I O X 低盐浓度的消化缓冲液 Ifxl ( I O U ) 相对应的限制性内切酶 37°C 孵 育 l h ,接着加入: 7. I O X 高盐浓度的消化缓冲液 1//1 ( I O U ) 相对应的限制性内切酶 37°C 孵 育 l h,同时做一个56沁 “ 无连接酶”的限制性内切消化反应的 平行对照。 ㉟ 估算连接产率。 a. 分别从含有连接酶和未含连接酶的限制性内切反应液中,各取出 3沁液体,分别与7沁变性上样缓冲液混合。 b.90°C 加热 5min。 c. 将混合液加到5 % 的聚丙烯酰胺T B E 厚胶的加样孔中。 d. *在 25V /c m 电压下,电 泳 30mi n。 e. 电泳结束后,把它放到磷屏仪上,通过比较反应物条带和 “ 非连接 酶”对照条带来估算连接产率,若连接产率> 9 0 % ,则可继续进行以下的 操作,若产率达不到要求,则需从步骤⑮ 开始重复操作。 ⑯ 在剩 下 的 限 制 性 内 切 产 物 ( 从步骤⑭ 中获得)中加人: 2. 5沁 l m m o l/L 生物素标记d N T P 0. 25pl 其他的 d N T P 各 l〇 m m o l / L 0. 3jd (3U ) 的 D N A 聚合酶I 的 K l e n o w 片段 25°C 孵育 20min。 ㉗ 按顺序加人: 3沁 0. 5mol/L 的 E D T A (p H 8. 0) 10沁非变性上样缓冲液
用 非 变 性 的 5 % 聚丙烯酰胺 T B E 厚 胶 ,电泳分析产物。电 压 为 25V /c m ,直 到溴酚蓝完全迁移到胶末端为止。 ⑩ 从凝胶上回收D N A 片段衍生物。 a•移去一块玻璃板,将胶用塑料膜包好,在胶上加两个放射自显影标 准物。 b. 室温,在 X 射线仪的胶片上曝光30〜60s,处理胶片。 c . 切下对应D N A 片段衍生物所在位置的胶片。 d. 采用白色的背景,将切下的胶片放在胶上,用放射自显影标记点作 为校对的参照点,对齐。 e. 使用一次性解剖刀切下相应于D N A 片段衍生物所在位置的胶条。 ⑩将切下的胶条放入一支硅化的I.5m l 聚丙烯小离心管内,用 一 个 I m l 的吸头 将胶条捣碎。加入400沁的洗脱缓冲液,轻摇一下, 37°C 振 荡 12h 。 @ 将上清移入一个S p in -X 离心过滤器中,在一个角度固定的小离心管中室温 13000g■离心 Imin。 ⑫ 将滤液转人一支硅化的I.5m l 聚丙烯小离心管中。加 入 I m l 冰冷的无水乙醇, 以沉淀D N A 片段衍生物。颠倒混 勻 , —2〇 °C 放 置 30mi n。 ⑬ 4°C 、 13000g ,在一个角度固定的小离心机中离心5m i n。 ⑭ 弃 上 清 ,用 500W 冰 冷 的 7 0 % 的 乙 醇 冲 洗 沉 淀 ,室 温 下 空 气 干 燥 ,约 IOm in0 ⑮ 用 30沁 含 低 浓 度 E D T A 的 T E 重悬沉淀。 ⑯ 用 C eren k o v法测定样品中的放射性物质含量。 ⑰ 从 样 品 中 取 出 溶 液 ,根据操作说明用 P ic o G reen 双 链 D N A 定量试剂盒, 测定其中的D N A 浓度。算 出 其 确 切 的 放 射 活 性 ( 预计确切活性约为 I. 8 5 X IO14B q / m o l, 即 50〇 0 C i/m m ol) ⑬ 将 D N A 片段衍生物在暗处保存于一2〇 °C ,片段可在约1 周内保持稳定。

二、蛋白质-DNA 复合体的制备及紫外照射

1.轻轻摇动存储瓶,重悬顺磁性小磁珠。取出 3u1 的溶液转入一个硅化过的 1.5 ml 小离心管中,低速离心。

2.将管放入磁性粒子收集器中,静置 30s 后去掉上清。

3.用 30jullX 结合洗脱缓冲液,重悬磁珠,用一微量吸管轻轻混勻,室温孵育磁珠 2 min。

4.低速离心。

5.将管放人磁性粒子收集器中,静置 30s 后去上清,重复步骤③?⑤。

6.用 10ul 2X 结合洗脱缓冲液,重悬磁珠,加人 2ul 60nmol/L 生物素标记的位点特异性 DNA 片段衍生物(从本方案 7.1 中步骤48获得)。25℃ 孵育 10 min,不时轻轻敲打管子以混匀液体。

7.将管子放入磁性粒子收集器中,静置 30s 后,将上清转入一支新的硅化的 L5 ml 小离心管中。

8.通过比较磁珠和上清的放射量来估算生物素标记位点特异性 DNA 片段衍生物的结合产率,若结合产率大于或等于 80%,可继续以下操作,若产率未达要求,则需从本方案 7.1 中步骤25 开始重复操作。

要点:这一步及以后的操作步骤都需在暗光条件下完成。必须避免荧光和日光照射,可采用低等或中等的发热光源(如 60W 钨灯泡灯)。

9.用 30ul 1 X 结合洗脱缓冲液,重悬磁珠,低速离心。

10.将管放人磁性粒子收集器中,静置 30s 后去掉上清。

11.用 30ul l X 结合洗脱缓冲液,重悬磁珠,低速离心。

12.将管放人磁性粒子收集器中,静置 30s 后去掉上清。

13.用 1 X 蛋白质结合缓冲液重悬磁珠,使 DNA 达到预定浓度,加入预定浓度的蛋白质,在合适的温度下,经合适的时间孵育混合液,孵育过程中不时轻轻敲打管子侧壁,以使液体充分混匀。

在这一步及下面的操作中,DNA 和蛋白质的浓度、反应的温度和时间都根据以往的经验进行设定,或是根据已知的复合体内各组分相互作用的知识来确定。

14.低速离心。

15.将管放入磁性粒子收集器中,静置 10s 后弃上清。

16.用预先孵育到合适温度的 50ul 1 X 蛋白结合缓冲液,重悬磁珠,在合适的温度下孵育 2 min。

17.将管子放人磁性粒子收集器中,静置 30 s 后弃掉上清。

任选:在这一步里,可以加入增强子、抑制子或效应分子(见 Kim,etal,2000a;Naryshkin,etal,2000)。

18.用预先孵育到合适温度的 20ul 1 X 蛋白结合缓冲液重悬磁珠,将混合液转入一支聚苯乙烯小离心管中,而后将管子插人一支预先孵育到合适温度的 13mmX100mm 的硼硅酸玻璃培养管中。

19.将管子放人光化学反应发生器中,用紫外线照射蛋白质 DNA 样品 20s(11ml/mm2 于 350nm)。

如果所需的反应温度高于或低于周围环境的温度至少 10°C 的话,可在硼硅酸玻璃培养菅中注满 H2O, 而后对其进行预孵育,直至 H2O 的温度达到合适的温度为止。

20.将悬液转入一支硅化的 1.5 ml 小离心管中,加入 7ul 的终止反应溶液,振荡混匀。

21.将管放入磁性粒子收集器中,静置 10 s,取出 17ul 的上清,立即进行第三部分的操作。

三、核酸酶消化

① 制备1〇沁的小磁珠悬液( 从本方案7.2步骤@ 获得)加人: Ijul 55m m o l / L 的 C a C U 0. 5^1 (5U ) 的微球菌核酸酶 0. 5/^1 (5U ) 的 D N A 酶工 37°C 孵育 5min ② 加 人 3|ul 5X S D S 上样缓冲液, 70°C 加 热 3m i n 以终止反应。 有 些 情 况 下 ( 这种情况极少),消化反应会产生两条带( 由于消化不完 全造成),在这种情况下,可选择另一种消化反应的操作方法。 a. 制 备 1 0 0 的 小 磁 珠 悬 液 ( 从本方案7. 2 中步骤㉑ 获得),需 加 人 1;/1 55m m o l / L 的 C a C U 和 〇. 5jul (5U ) 的 D N A 酶 I , 37。。孵育 IOmin0
b. 加 人 ljLdl〇%S D S , 65°C 加 热 5m i n 以终止反应。 c. 当样品冷却至室温时,加 人 ljul25m m o l /L 的 Z n C U V > llmol/L 的 醋酸〈丨〉和 Ijul (30U ) 的 S l 核酸酶, 37°C 孵 育 lOmin。 d. 加 入 3ju1 5 X S D S 上样缓冲液, 70°C 加 热 3m i n 以终止反应

四、发生交联反应的蛋白质的鉴定

① 将 所 有 的 样 品 (16沁,从 本 方 案 7. 3 中步骤②获得)加到聚丙烯酰胺平板胶 加样孔中,在旁边的上样孔中,加 5沁预染色蛋白分子量标准。 ② 以 25V /c m 的电压,在 S D S 电泳缓冲液中进行电泳,直至溴酚蓝迁移至胶的 末端为止。 ③ 取下胶后将胶干燥,进行放射自显影或磷屏曝光。 实 例 研 究 : E .coG R N A 聚 合 酶 转 录 起 始 复 合 体 本方案已成功地用于分析E1.coZz R N A 聚合酶转录起始复合体( Naryshkin, e t a l , 2000, 2 0 0 1 ; 未发表)。研究结果已用于分析R N A 聚合酶启动子开放复合体的结构组 成 ( R P O ; Naryshkin, e t a l , 2000)、 R N A 聚合酶-启动子开放复合体形成的过程中可 能存在的一种媒介物的结构分析( R P ]5t; N N aryshkm , e t a l, 未发表),以及转录増 强子对RP◦ 和RPist.结构组成影响的分析( Naryshkin, e ta l, 2 0 0 0 ; 未发表)

来源:丁香实验

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