isogen法 RNA及DNA及蛋白质的单离
丁香园论坛
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我们试验使用的是ISOGEN 于是我就贴上来了 希望有人能看懂吧
没办法啊 在日本也只能找到日文的说明
ISOGEN法の原理
ISOGEN及びISOGEN-LSは、ヒト、動物、植物及び細菌からのRNA抽出用試薬である。液相分離による方法を用いており、同一試料からDNA、タンパク質も単離することが可能である。一連の操作で、RNA、DNA、タンパク質を単離できるので、貴重な試料に有効であり、また、操作が簡単なので、試料数が多い場合にも便利である。
ISOGEN及びISOGEN-LSは、フェノールとチオシアン酸グアニジンを含む均一な液体である。ISOGENは組織や培養細胞等の試料に、ISOGEN-LSは血液等、容量が大きく（＞100µl:1.5mlプラスチックチューブで処理する場合）、さらに濃縮が面倒な液体試料に有効である。ISOGEN-LSはISOGENを液体試料用に改良したもので、ISOGENよりもフェノール含量が多くなっている。試料に加えるISOGEN-LSの量比が異なる以外はISOGENと同じである。試料にISOGENまたはISOGEN-LSを加えて溶解またはホモジナイゼーションした後、クロロホルムを加えて遠心分離するとホモジネートは水相、有機相及び中間相の3相に分離する。水相にはRNAのみが存在し、DNAとタンパク質は中間相以下に存在する。従って、まず、水相を採取してイソプロパノールを加えてRNAを沈殿させ、残った中間相と有機相にエタノールを加えてDNAを、さらに、イソプロパノールを加えてタンパク質を沈殿させることによりRNA、DNA及びタンパク質を順次単離することができる。
ISOGEN, ISOGEN-LS プロトコール(RNAの単離)
[プロトコール1-1 RNAの単離]
以下の操作は、RNaseのコンタミを防ぐとともに安全のために手袋を着用し、清潔な環境で行う。なお、クロロホルム、イソプロパノール及びエタノールは別に準備しなければならない。また、チューブは透明なポリプロピレン製を用いるとよい。
samplundefined1)
(for ISOGEN:50-100mg tissue, 10cm2 of culture plate, 5-10×106 cells)
(for ISOGEN-LS:0.25ml liquid sample)
↓ add 1ml of ISOGEN or 0.75ml ISOGEN-LS
↓ lysis or homogenizatioundefined2)
↓ store for 5min. at room temperaturundefined3)
↓ add 0.2ml of chloroforundefined4)
↓ shake vigorously for 15sec.
↓ store for 2-3min. at room temperature
↓ 12K×g for 15min. at 4°undefined5)
↓→→→→→interphase and organic phasundefined6)
↓（for subsequent isolation of DNA[protocol 2] and proteins[protocol 3] ）
↓
aqueous phasundefined7)
↓ add 0.5ml of isopropanol
↓ store for 5-10min. at room temperaturundefined8)
↓ 12K×g for 10min. at 4°C
precipitatundefined9)
↓ add at least 1ml of 75% ethanol
↓ vorteundefined10)
↓ 7.5K×g for 5min. at 4°undefined11)
precipitate
↓ dry brieflundefined12)
↓ add ddH2O, TE(pH8.0) or 0.5% SDS
↓ dissolve
total RNA solutioundefined7~undefined13)
--------------------------------------------------------------------------------
~undefined1）1.5mlプラスチックチューブを用いて処理する場合、組織や培養細胞等、試料の体積が100µl以下のものにはISOGEN、血液等、試料の体積が大きい(100µlを越える)ものにはISOGEN-LSが有効である。試料の体積が大きくても、濃縮により100µl以下にできる場合にはISOGENを使用することができる。
培養細胞などの試料の場合、培地などの水分は可能な限り除去する。
ISOGEN-LSを用いて液体試料を処理する場合、試料の容量が0.25ml以下の時には、水を加えて0.25mlにする。ISOGEN-LSと容量比が常に3：1になるようにする。血液や血清のように多くの成分が含まれる液体試料は、水で2倍に希釈してからISOGEN-LSを加える。
~undefined2）組織の場合は、ガラス・テフロンあるいはポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイゼーションする。また、培養皿に付着して増殖した細胞の場合には、10cm2当たり1mlのISOGENを直接加えてピペットで吸出して溶解する。細胞懸濁液の場合には遠心して沈殿させた後、5-10×106cells当たり1mlのISOGENを加えて同様にピペットで吸出して溶解する。筋、脂肪細胞、植物のようにタンパク質、脂質等などを多く含む試料の場合は、ホモジナイゼーション後に一度遠心(12K×g, 10min., 4°C)して、上清を以下の操作に用いる。この時脂肪は最上層に位置することに注意する。
~undefined3）この状態で-70°Cで少なくとも1か月は保存できる。
~undefined4）イソアミルアルコール等の添加物のないクロロホルムを用いる。
~undefined5）ホモジネートは、遠心分離により下層の有機相、中間相及び上層の水相にわかれる。RNAは水相に含まれるが、この水相にはDNAやタンパク質はほとんど含まれない。この時の水相の体積は加えたISOGENの体積の約60%である。
~undefined6）ここで得られた中間相と有機相はそれぞれDNA及びタンパク質を単離するため、4°Cにて保存する。ただし、中間相や有機相中に多量の不溶物(カス状、繊維状のもの等)がある場合、DNA及びタンパク質の単離には適さない。
~undefined7）DNAやタンパク質との夾雑を少なくすることによりRNAの回収率を上げるため、4中間相や有機相ができるだけ混入しないように、水相を新しいチューブに移して以下の操作を行う。ゲノムDNAのコンタミが予想される場合には新しいチューブに移した水相に等量のクロロホルムを加え、再抽出を行う。ポリサッカライド、プロテオグリカン、グリコーゲン等の夾雑物が含まれることが予想される場合、あるいは最終的に得られたRNAに含まれていることが確認された場合には、high-salt precipitation solution(1.2M NaCl, 0.8M sodium citrare, pH未調整)とイソプロパノールをそれぞれ水相の1/2容量加えてイソプロパノール沈殿を行い、10K×g, 15分遠心してRNAのみを沈殿させると効果的である。この後75%エタノールによる洗浄を行う。
RNA量が10µg以下の場合は、水相にEthachinmateを加えることにより、RNAの収率を上げることができる。
~undefined8）この状態で、通常RNAの沈殿は見えない。
~undefined9）RNAの沈殿は、ゲル様のペレットとしてチューブの内壁と底に付着する。
~undefined10）この状態で4°Cで少なくとも1週間、-20°Cであれば1年間は保存することができる。
~undefined11）もしRNAの沈殿がチューブの内壁から流れ出しそうな状態の場合は、エタノール洗浄後の遠心は12K×gにて行う。
~undefined12）RNAの沈殿は、風乾または5-10分間真空乾燥する。真空遠心機を用いて乾燥してはいけない。沈殿を完全に乾燥してしまうと溶解性が著しく減少する。溶解性が減少したRNAのOD260/OD280>は、1.6以下なので目安となる。得られたRNAは、滅菌蒸留水、TE(pH8.0)または0.5% SDSにピペットチップで吸出して溶解し、55-60°Cにて10-15分間保温すると良い。溶解する滅菌蒸留水、TE(pH8.0)、0.5% SDSは、あらかじめジエチルピロカーボネート(DEPC)処理によってRNaseフリーにしておく。
~undefined13）得られたRNAをアガロースゲル電気泳動すると、主に約2kbと5kbのリボソームRNAのバンドの他に0.1-0.3kbの低分子RNAと、7-15kbの高分子RNAを観察することができる。得られたRNAのOD260/OD280は、1.6-1.8である。
ISOGEN, ISOGEN-LS プロトコール(DNAの単離)
--------------------------------------------------------------------------------
[プロトコール2 DNAの単離]
以下の操作は、安全のために手袋を着用して行う。なお、エタノール及びくえん酸ナトリウムは別に準備しなければならない。[プロトコール2 DNAの単離]は、[プロトコール1-1 RNAの単離]でISOGEN 1mlまたはISOGEN-LS 0.75mlを用いた場合に対応する。
interphase and organic phase [protocol 1-1~undefined1)
↓ add 0.3ml of ethanol
↓ mix by inversion
↓ store for 2-3min. at room temperature
↓ 2K×g for 5min. at 4°C
↓→→→→supernatant (for susequent isolation of proteins[protocol 3] )
↓
precipitate
↓ add 1ml of 0.1M sodium citrate in 10% ethanoundefined2) *3)
↓ store for 30min. at room temperature (with periodic mixing~undefined3)
↓ 2K×g for 5min. at 4°undefined3)
precipitate
↓ add 1ml of 0.1M sodium citrate in 10% ethanoundefined2) *3)
↓ store for 30min. at room temperature (with periodic mixing~undefined3)
↓ 2K×g for 5min. at 4°undefined3)
precipitate
↓ add 1ml of 0.1M sodium citrate in 10% ethanoundefined2) *3)
↓ store for 30min. at room temperature (with periodic mixing~undefined3)
↓ 2K×g for 5min. at 4°undefined3)
precipitate
↓ add 2ml of 75% ethanol
↓ store for 30min. at room temperature (with periodic mixing~undefined4)
↓ 2K×g for 5min. at 4°C
precipitate
↓ dry brieflundefined5)
↓ add ddH2O, TE(pH8.0) or 0.5% SDS
↓ dissolvundefined6)
DNA solutioundefined7)
--------------------------------------------------------------------------------
~undefined1)純度の高いDNAを得るには、残存する水相を注意深く完全に除去しなければならない。中間相と有機相は4°Cで一晩保存してもよい。
~undefined2)0.1Mくえん酸ナトリウム in エタノール調製方法
1Mくえん酸ナトリウム10ml及びエタノール10mlに、100mlになるように滅菌蒸留水を加え、混合する。(1Mくえん酸ナトリウム調製方法：くえん酸三ナトリウム二水和物29.4gを蒸留水にて溶解し、100mlにメスアップし、オートクレーブで121°C20分滅菌する。)
~undefined3)洗浄の時間を短縮してはいけない。DNA量が200µg以上の時や、DNA以外の成分が非常に多いときは、さらに洗浄を行う。
~undefined4)この状態で4°Cで数か月は保存できる。
~undefined5)5-10分間真空乾燥させる。完全に乾燥させるとDNAの溶解が著しく困難になる。
~undefined6)ピペットにて穏やかに吸出して溶解する。この段階で、特に組織よりDNAを単離した場合に、さらに不溶性のゲル様の物質が含まれていることがある。その時は、遠心分離(12K×g,10min.)により除去する。不溶性物質をさらに溶解したい場合には最終濃度8mMNaOHを加えることにより、効果が得られることがある。また、この状態で4°Cで一晩保存することができるが、長時間保存するときはTE(pH8.0)で溶解した場合はそのまま、滅菌蒸留水で溶解した場合はTris-HCl(pH8.0)を最終濃度10mM、EDTAを最終濃度1mMになるように加える。NaOHで溶解した場合はHEPESで下記の表を参考にしてpHを7-8に調製し、EDTAを最終濃度1mMになるように加える。
~undefined7)この時に不溶沈殿物が認められる。さらに純度を高めたい場合にはフェノール/クロロホルム処理をしてもよい。ただし、この場合には収量が下がることがある。[プロトコール2]に従ってDNAを単離すると、細胞の場合は60-100kbのDNAが約70%、60-20kbのDNAが約30%、培養細胞の場合は60-100kbのDNAが約80%、60-20kbのDNAが約20%得られる。しかし、DNAの平均長は、ホモジナイゼーション中のせん断力の強さに依存するので、大きなDNA断片を得たいときにはポリトロンホモジナイザーのような強力なものを避ける。得られたDNA溶液は、水で希釈してOD260を測定して収量を計算する。1 OD260=50µgds DNA/mlである。収量の目安は、106個のヒト、ラット、マウス細胞でそれぞれ7.1µg、6.5µg、5.8µgである。得られるDNAは、RNA及びタンパク質をほとんど含まず、OD260/OD280は1.7以上である。PCRや制限酵素の基質として用いる場合、滅菌蒸留水またはTE(pH8.0)で溶解した時にはそのまま使用できるが、終濃度8mMNaOHで溶解した時はあらかじめpHをHEPES添加または透析による調整が必要である。HEPESによる調整は下記の表を参考にするとよい。この方法で得たDNAは、1µg当たり3-5unitsの制限酵素により、3-24時間でその80-90%を切断することができる。
final pH required HEPES concentration(M) required HEPES volume
(µl/ml 8mM NaOH)
8.4
8.2
8.0
7.8
7.5
7.2
7.0 0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
1
1 66
90
115
135
180
30
42
ISOGEN, ISOGEN-LS プロトコール(タンパク質の単離)
--------------------------------------------------------------------------------
[プロトコール3 タンパク質の単離]
以下の操作は、安全のために手袋を着用して行う。なお、塩酸グアニジン、SDS、エタノール及びイソプロパノールは別に準備しなければならない。[プロトコール3]は、前述の[プロトコール1-1]でISOGEN 1mlまたはISOGEN-LS 0.75mlを用いた場合に対応する。
supernatant[protocol 2~undefined1)
↓ add 1.5ml of isopropanol
↓ store for 10min. at room temperature
↓ 12K×g for 10min. at 4°C
precipitate
↓ add 2ml of 0.3M guanidine hydrochloride in 95% ethanoundefined2)
↓ store for 20min. at room temperature
↓ 7.5K×g for 5min. at 4°C
precipitate
↓ add 2ml of 0.3M guanidine hydrochloride in 95% ethanoundefined2)
↓ store for 20min. at room temperature
↓ 7.5K×g for 5min. at 4°C
precipitate
↓ add 2ml of 0.3M guanidine hydrochloride in 95% ethanoundefined2)
↓ store for 20min. at room temperature
↓ 7.5K×g for 5min. at 4°C
precipitate
↓ add 2ml of 0.3M guanidine hydrochloride in 95% ethanoundefined2)
↓ store for 20min. at room temperature
↓ 7.5K×g for 5min. at 4°C
precipitate
↓ add 2ml of ethanol
↓ store for 20min. at room temperature
↓ 7.5K×g for 5min. at 4°C
precipitate
↓ dry brieflundefined3)
↓ add 1% SDS
↓ dissolvundefined4)
protein solutioundefined5)
--------------------------------------------------------------------------------
~undefined1)プロトコールに従えば上清の量は約0.8mlである。0.1%SDSにて4°Cで透析すると、収量が上がることがある。
~undefined2)この状態で4°Cで少なくとも1か月あるいは、-20°Cで少なくとも1年間保存できる。
~undefined3)5-10分間真空乾燥させる。
~undefined4)完全に溶解するためには50°Cで保温しなければならない。
~undefined5)不溶物は遠心分離(10K×g, 10min., 4°C)により除去する。得られたタンパク質はそのままウエスタンブロッティングに使用できる。また、-20°Cで保存できる。
没办法啊 在日本也只能找到日文的说明
ISOGEN法の原理
ISOGEN及びISOGEN-LSは、ヒト、動物、植物及び細菌からのRNA抽出用試薬である。液相分離による方法を用いており、同一試料からDNA、タンパク質も単離することが可能である。一連の操作で、RNA、DNA、タンパク質を単離できるので、貴重な試料に有効であり、また、操作が簡単なので、試料数が多い場合にも便利である。
ISOGEN及びISOGEN-LSは、フェノールとチオシアン酸グアニジンを含む均一な液体である。ISOGENは組織や培養細胞等の試料に、ISOGEN-LSは血液等、容量が大きく（＞100µl:1.5mlプラスチックチューブで処理する場合）、さらに濃縮が面倒な液体試料に有効である。ISOGEN-LSはISOGENを液体試料用に改良したもので、ISOGENよりもフェノール含量が多くなっている。試料に加えるISOGEN-LSの量比が異なる以外はISOGENと同じである。試料にISOGENまたはISOGEN-LSを加えて溶解またはホモジナイゼーションした後、クロロホルムを加えて遠心分離するとホモジネートは水相、有機相及び中間相の3相に分離する。水相にはRNAのみが存在し、DNAとタンパク質は中間相以下に存在する。従って、まず、水相を採取してイソプロパノールを加えてRNAを沈殿させ、残った中間相と有機相にエタノールを加えてDNAを、さらに、イソプロパノールを加えてタンパク質を沈殿させることによりRNA、DNA及びタンパク質を順次単離することができる。
ISOGEN, ISOGEN-LS プロトコール(RNAの単離)
[プロトコール1-1 RNAの単離]
以下の操作は、RNaseのコンタミを防ぐとともに安全のために手袋を着用し、清潔な環境で行う。なお、クロロホルム、イソプロパノール及びエタノールは別に準備しなければならない。また、チューブは透明なポリプロピレン製を用いるとよい。
samplundefined1)
(for ISOGEN:50-100mg tissue, 10cm2 of culture plate, 5-10×106 cells)
(for ISOGEN-LS:0.25ml liquid sample)
↓ add 1ml of ISOGEN or 0.75ml ISOGEN-LS
↓ lysis or homogenizatioundefined2)
↓ store for 5min. at room temperaturundefined3)
↓ add 0.2ml of chloroforundefined4)
↓ shake vigorously for 15sec.
↓ store for 2-3min. at room temperature
↓ 12K×g for 15min. at 4°undefined5)
↓→→→→→interphase and organic phasundefined6)
↓（for subsequent isolation of DNA[protocol 2] and proteins[protocol 3] ）
↓
aqueous phasundefined7)
↓ add 0.5ml of isopropanol
↓ store for 5-10min. at room temperaturundefined8)
↓ 12K×g for 10min. at 4°C
precipitatundefined9)
↓ add at least 1ml of 75% ethanol
↓ vorteundefined10)
↓ 7.5K×g for 5min. at 4°undefined11)
precipitate
↓ dry brieflundefined12)
↓ add ddH2O, TE(pH8.0) or 0.5% SDS
↓ dissolve
total RNA solutioundefined7~undefined13)
--------------------------------------------------------------------------------
~undefined1）1.5mlプラスチックチューブを用いて処理する場合、組織や培養細胞等、試料の体積が100µl以下のものにはISOGEN、血液等、試料の体積が大きい(100µlを越える)ものにはISOGEN-LSが有効である。試料の体積が大きくても、濃縮により100µl以下にできる場合にはISOGENを使用することができる。
培養細胞などの試料の場合、培地などの水分は可能な限り除去する。
ISOGEN-LSを用いて液体試料を処理する場合、試料の容量が0.25ml以下の時には、水を加えて0.25mlにする。ISOGEN-LSと容量比が常に3：1になるようにする。血液や血清のように多くの成分が含まれる液体試料は、水で2倍に希釈してからISOGEN-LSを加える。
~undefined2）組織の場合は、ガラス・テフロンあるいはポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイゼーションする。また、培養皿に付着して増殖した細胞の場合には、10cm2当たり1mlのISOGENを直接加えてピペットで吸出して溶解する。細胞懸濁液の場合には遠心して沈殿させた後、5-10×106cells当たり1mlのISOGENを加えて同様にピペットで吸出して溶解する。筋、脂肪細胞、植物のようにタンパク質、脂質等などを多く含む試料の場合は、ホモジナイゼーション後に一度遠心(12K×g, 10min., 4°C)して、上清を以下の操作に用いる。この時脂肪は最上層に位置することに注意する。
~undefined3）この状態で-70°Cで少なくとも1か月は保存できる。
~undefined4）イソアミルアルコール等の添加物のないクロロホルムを用いる。
~undefined5）ホモジネートは、遠心分離により下層の有機相、中間相及び上層の水相にわかれる。RNAは水相に含まれるが、この水相にはDNAやタンパク質はほとんど含まれない。この時の水相の体積は加えたISOGENの体積の約60%である。
~undefined6）ここで得られた中間相と有機相はそれぞれDNA及びタンパク質を単離するため、4°Cにて保存する。ただし、中間相や有機相中に多量の不溶物(カス状、繊維状のもの等)がある場合、DNA及びタンパク質の単離には適さない。
~undefined7）DNAやタンパク質との夾雑を少なくすることによりRNAの回収率を上げるため、4中間相や有機相ができるだけ混入しないように、水相を新しいチューブに移して以下の操作を行う。ゲノムDNAのコンタミが予想される場合には新しいチューブに移した水相に等量のクロロホルムを加え、再抽出を行う。ポリサッカライド、プロテオグリカン、グリコーゲン等の夾雑物が含まれることが予想される場合、あるいは最終的に得られたRNAに含まれていることが確認された場合には、high-salt precipitation solution(1.2M NaCl, 0.8M sodium citrare, pH未調整)とイソプロパノールをそれぞれ水相の1/2容量加えてイソプロパノール沈殿を行い、10K×g, 15分遠心してRNAのみを沈殿させると効果的である。この後75%エタノールによる洗浄を行う。
RNA量が10µg以下の場合は、水相にEthachinmateを加えることにより、RNAの収率を上げることができる。
~undefined8）この状態で、通常RNAの沈殿は見えない。
~undefined9）RNAの沈殿は、ゲル様のペレットとしてチューブの内壁と底に付着する。
~undefined10）この状態で4°Cで少なくとも1週間、-20°Cであれば1年間は保存することができる。
~undefined11）もしRNAの沈殿がチューブの内壁から流れ出しそうな状態の場合は、エタノール洗浄後の遠心は12K×gにて行う。
~undefined12）RNAの沈殿は、風乾または5-10分間真空乾燥する。真空遠心機を用いて乾燥してはいけない。沈殿を完全に乾燥してしまうと溶解性が著しく減少する。溶解性が減少したRNAのOD260/OD280>は、1.6以下なので目安となる。得られたRNAは、滅菌蒸留水、TE(pH8.0)または0.5% SDSにピペットチップで吸出して溶解し、55-60°Cにて10-15分間保温すると良い。溶解する滅菌蒸留水、TE(pH8.0)、0.5% SDSは、あらかじめジエチルピロカーボネート(DEPC)処理によってRNaseフリーにしておく。
~undefined13）得られたRNAをアガロースゲル電気泳動すると、主に約2kbと5kbのリボソームRNAのバンドの他に0.1-0.3kbの低分子RNAと、7-15kbの高分子RNAを観察することができる。得られたRNAのOD260/OD280は、1.6-1.8である。
ISOGEN, ISOGEN-LS プロトコール(DNAの単離)
--------------------------------------------------------------------------------
[プロトコール2 DNAの単離]
以下の操作は、安全のために手袋を着用して行う。なお、エタノール及びくえん酸ナトリウムは別に準備しなければならない。[プロトコール2 DNAの単離]は、[プロトコール1-1 RNAの単離]でISOGEN 1mlまたはISOGEN-LS 0.75mlを用いた場合に対応する。
interphase and organic phase [protocol 1-1~undefined1)
↓ add 0.3ml of ethanol
↓ mix by inversion
↓ store for 2-3min. at room temperature
↓ 2K×g for 5min. at 4°C
↓→→→→supernatant (for susequent isolation of proteins[protocol 3] )
↓
precipitate
↓ add 1ml of 0.1M sodium citrate in 10% ethanoundefined2) *3)
↓ store for 30min. at room temperature (with periodic mixing~undefined3)
↓ 2K×g for 5min. at 4°undefined3)
precipitate
↓ add 1ml of 0.1M sodium citrate in 10% ethanoundefined2) *3)
↓ store for 30min. at room temperature (with periodic mixing~undefined3)
↓ 2K×g for 5min. at 4°undefined3)
precipitate
↓ add 1ml of 0.1M sodium citrate in 10% ethanoundefined2) *3)
↓ store for 30min. at room temperature (with periodic mixing~undefined3)
↓ 2K×g for 5min. at 4°undefined3)
precipitate
↓ add 2ml of 75% ethanol
↓ store for 30min. at room temperature (with periodic mixing~undefined4)
↓ 2K×g for 5min. at 4°C
precipitate
↓ dry brieflundefined5)
↓ add ddH2O, TE(pH8.0) or 0.5% SDS
↓ dissolvundefined6)
DNA solutioundefined7)
--------------------------------------------------------------------------------
~undefined1)純度の高いDNAを得るには、残存する水相を注意深く完全に除去しなければならない。中間相と有機相は4°Cで一晩保存してもよい。
~undefined2)0.1Mくえん酸ナトリウム in エタノール調製方法
1Mくえん酸ナトリウム10ml及びエタノール10mlに、100mlになるように滅菌蒸留水を加え、混合する。(1Mくえん酸ナトリウム調製方法：くえん酸三ナトリウム二水和物29.4gを蒸留水にて溶解し、100mlにメスアップし、オートクレーブで121°C20分滅菌する。)
~undefined3)洗浄の時間を短縮してはいけない。DNA量が200µg以上の時や、DNA以外の成分が非常に多いときは、さらに洗浄を行う。
~undefined4)この状態で4°Cで数か月は保存できる。
~undefined5)5-10分間真空乾燥させる。完全に乾燥させるとDNAの溶解が著しく困難になる。
~undefined6)ピペットにて穏やかに吸出して溶解する。この段階で、特に組織よりDNAを単離した場合に、さらに不溶性のゲル様の物質が含まれていることがある。その時は、遠心分離(12K×g,10min.)により除去する。不溶性物質をさらに溶解したい場合には最終濃度8mMNaOHを加えることにより、効果が得られることがある。また、この状態で4°Cで一晩保存することができるが、長時間保存するときはTE(pH8.0)で溶解した場合はそのまま、滅菌蒸留水で溶解した場合はTris-HCl(pH8.0)を最終濃度10mM、EDTAを最終濃度1mMになるように加える。NaOHで溶解した場合はHEPESで下記の表を参考にしてpHを7-8に調製し、EDTAを最終濃度1mMになるように加える。
~undefined7)この時に不溶沈殿物が認められる。さらに純度を高めたい場合にはフェノール/クロロホルム処理をしてもよい。ただし、この場合には収量が下がることがある。[プロトコール2]に従ってDNAを単離すると、細胞の場合は60-100kbのDNAが約70%、60-20kbのDNAが約30%、培養細胞の場合は60-100kbのDNAが約80%、60-20kbのDNAが約20%得られる。しかし、DNAの平均長は、ホモジナイゼーション中のせん断力の強さに依存するので、大きなDNA断片を得たいときにはポリトロンホモジナイザーのような強力なものを避ける。得られたDNA溶液は、水で希釈してOD260を測定して収量を計算する。1 OD260=50µgds DNA/mlである。収量の目安は、106個のヒト、ラット、マウス細胞でそれぞれ7.1µg、6.5µg、5.8µgである。得られるDNAは、RNA及びタンパク質をほとんど含まず、OD260/OD280は1.7以上である。PCRや制限酵素の基質として用いる場合、滅菌蒸留水またはTE(pH8.0)で溶解した時にはそのまま使用できるが、終濃度8mMNaOHで溶解した時はあらかじめpHをHEPES添加または透析による調整が必要である。HEPESによる調整は下記の表を参考にするとよい。この方法で得たDNAは、1µg当たり3-5unitsの制限酵素により、3-24時間でその80-90%を切断することができる。
final pH required HEPES concentration(M) required HEPES volume
(µl/ml 8mM NaOH)
8.4
8.2
8.0
7.8
7.5
7.2
7.0 0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
1
1 66
90
115
135
180
30
42
ISOGEN, ISOGEN-LS プロトコール(タンパク質の単離)
--------------------------------------------------------------------------------
[プロトコール3 タンパク質の単離]
以下の操作は、安全のために手袋を着用して行う。なお、塩酸グアニジン、SDS、エタノール及びイソプロパノールは別に準備しなければならない。[プロトコール3]は、前述の[プロトコール1-1]でISOGEN 1mlまたはISOGEN-LS 0.75mlを用いた場合に対応する。
supernatant[protocol 2~undefined1)
↓ add 1.5ml of isopropanol
↓ store for 10min. at room temperature
↓ 12K×g for 10min. at 4°C
precipitate
↓ add 2ml of 0.3M guanidine hydrochloride in 95% ethanoundefined2)
↓ store for 20min. at room temperature
↓ 7.5K×g for 5min. at 4°C
precipitate
↓ add 2ml of 0.3M guanidine hydrochloride in 95% ethanoundefined2)
↓ store for 20min. at room temperature
↓ 7.5K×g for 5min. at 4°C
precipitate
↓ add 2ml of 0.3M guanidine hydrochloride in 95% ethanoundefined2)
↓ store for 20min. at room temperature
↓ 7.5K×g for 5min. at 4°C
precipitate
↓ add 2ml of 0.3M guanidine hydrochloride in 95% ethanoundefined2)
↓ store for 20min. at room temperature
↓ 7.5K×g for 5min. at 4°C
precipitate
↓ add 2ml of ethanol
↓ store for 20min. at room temperature
↓ 7.5K×g for 5min. at 4°C
precipitate
↓ dry brieflundefined3)
↓ add 1% SDS
↓ dissolvundefined4)
protein solutioundefined5)
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~undefined1)プロトコールに従えば上清の量は約0.8mlである。0.1%SDSにて4°Cで透析すると、収量が上がることがある。
~undefined2)この状態で4°Cで少なくとも1か月あるいは、-20°Cで少なくとも1年間保存できる。
~undefined3)5-10分間真空乾燥させる。
~undefined4)完全に溶解するためには50°Cで保温しなければならない。
~undefined5)不溶物は遠心分離(10K×g, 10min., 4°C)により除去する。得られたタンパク質はそのままウエスタンブロッティングに使用できる。また、-20°Cで保存できる。
