原理
材料与仪器
TE 酶切缓冲液 EDTA
恒温水浴锅
步骤
1. 混合下列溶液于一个无菌的微量离心管中
(1)x μl DNA
(2)2 μl 10×酶切缓冲液
(3)18-x μl H2O
(4)20 μl 的反应体积可以方便地用于聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析。
(5)只要反应混合物中其他成分的比例保持一定,可增减待切割DNA的量和反应条件。
2. 加入限制性内切酶(1——5 U/μg DNA)在推荐的温度温育1 h (—般是37℃)。
3. 理论上,1 U 限制性内切酶在推荐的反应条件下,60 min 内可完全消化1 μg 纯化的样品。
4. 酶的体积应低于反应总体积的1/10,因为酶液中的甘油可以干扰反应。
5. 加入5 μl 电泳加样缓冲液终止反应,进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳。
6. 反应也可通过加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA(终浓度为12. 5 mol/l) 以螯合镁离于而终止。
7. 很多酶再65℃温育10 min 可被不可逆灭活,有些不能在65℃热失活的酶在75℃温育15 min 也能失活。
8. 如果酶对热具完全抗性,可遍过酚抽提和乙醇沉淀或通过硅基质悬浮法来纯化DNA。
注意事项
常见问题
1.分子克隆是微量操作技术,DNA样品与限制性内切酶的用量都极少,必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。
2.要注意酶切时加样的次序,一般次序为水、缓冲液、DNA各项试剂,最后才加酶液。取液时,Tip头要从溶液表面吸取,以防止Tip头沾去过多的液体与酶,待用的内切酶要放在冰浴内,用后盖紧盖子,立即放回-20℃冰箱,防止限制性内切酶的失活。
3.凡用在酶切反应中的一切塑料器皿(Eppendorf管,Tip头等),都要新的,最后用重蒸水清洗,湿热灭菌,置50℃温箱中烘干,使用前打开包装,用镊子夹取,不直接用手去拿,严防手上杂酶污染。
4.当样品在37℃与65℃保温时,要注意:
(1)防止因盖子未盖严密使水汽进入管内,使反应溶液体积大量增加,造成实验失败。
(2)防止由于标签脱落,分不清样品类型。
5.由于温差原因,往往在盖上有水汽,因此样品酶切完毕或中间取样电泳要离心2秒钟,以集中体积内溶液,否则会发现酶切后体积少了。
来源:丁香实验