核酸外切酶三介导克隆突然做不成功了

之前一直用的核酸外切酶iii做的不依赖连接酶方法克隆，阳性率挺高的，但是这个月一直做不成功，具体我的步骤如下：一. PCR扩增含目的基因及载体同源15bp片段

二. PCR产物进行胶回收。

三. 37℃酶切载体

四. 载体双酶切产物行乙醇沉淀法纯化。

五. ExonucleaseIII介导的DNA克隆

1.50ng克隆片段

25ng载体

1ul exonucleaseIII Buffer

双蒸水 补足总量为9ul

混匀放置冰上5min。

2.加入1ul exonuclease III（20U/L）吹吸混匀后继续冰浴60min。

3.加入1ul 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)终止反应，用移液枪混匀后置于60℃水浴5min，再冰浴5min。

4.取反应产物转化DH5α涂板。

六．菌落PCR筛选

七 . 双酶切鉴定

现在问题是转化后一直不长菌，引物这些我都核对过了没问题，感受态也检查了没问题，请教有没有有经验的给点指导意见！