如何用 TRIzol 试剂提取 RNA,DNA,蛋白质？

TRIzol 试剂适用于从细胞和组织中快速分离 RNA。TRIzol 试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚／SDS 法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的 RNA\DNA\蛋白质。TRIzol 使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有 RNase 抑制剂可保持 RNA 的完整性。

在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA 在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收 RNA；用乙醇沉淀中间层可回收 DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

TRIzol 试剂可用于小量样品（50-100mg 组织、5×106 细胞）也适用于大量样品（≥1g 组织、>107 细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。

分离的总 RNA 无蛋白质和 DNA 污染，可用于 Northern Blot，dot blot，ployA 筛选，体外翻译，RNase 保护分析和分子克隆。在用于 RT-PCR 时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无 RNase 的 DNaseⅠ处理 RNA 样品，避免出现假阳性。

共纯化的 DNA 可用作标准，比较不同样品 RNA 的得率，也可用于 PCR 和酶切。蛋白质可用于 Western Blotting

规格：100ml 黄色透明液体

储存条件：2-8℃ 避光保存 12 个月

注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。

预防 RNase 污染注意事项

1． 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为 RNase 的来源。

2． 使用灭过菌的 RNA 专用塑料制品避免交叉污染。

3． RNA 在 TRIzol 试剂中时不会被 RNase 污染，但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃ 烘烤 4 小时，塑料制品可在0.5M NaOH 中浸泡 10 分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除 RNase。

4． 配制溶液应使用无 RNase 的水（将水加入处理过不含 RNase 的玻璃瓶中，加入 DEPC 至终浓度 0.01℅v/v,放置过夜,高压灭菌。注：DEPC 有致癌之嫌，需小心操作。）

一、RNA 的提取

准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅ 乙醇，无 RNase 的水或 0.5℅SDS (溶液均需用DEPC 处理过的水配制)

操作步骤

1. 匀浆处理:

a.组织将组织在液氮中磨碎,每 50-100mg 组织加入 1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过 TRIzol 体积 10℅。

b.单层培养细胞 直接在培养板中加入 TRIzol 裂解细胞，每 10cm2 面积(即 3.5cm 直径的培养板)加 1ml，用移液器吸打几次。TRIzol 的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol 加量不足可能导致提取的 RNA 有 DNA 污染。

c．细胞悬液 离心收集细胞，每 5-10×106 动物、植物、酵母细胞或 1×107 细菌细胞加入 1ml TRIzol，反复吸打。加 TRIzol 之前不要洗涤细胞以免 mRNA 降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置 5 分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于 2-8℃10000×g 离心 10 分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量 DNA，上清中含有 RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

4. 每使用 1ml TRIzol 加入 0.2ml 氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温放置 3 分钟。

5. 2-8℃10000×g 离心 15 分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA 主要在水相中，水相体积约为所用 TRIzol 试剂的 60℅。

6. 把水相转移到新管中，如要分离 DNA 和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的 RNA。每使用 1ml TRIzol 加入 0.5ml 异丙醇，室温放置 10分钟。

7. 2-8℃ 10000×g 离心 10 分钟，离心前看不出 RNA 沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

8. 用 75℅乙醇洗涤 RNA 沉淀。每使用 1ml TRIzol 至少加 1ml 75℅乙醇。2-8℃ 不超过 7500×g 离心 5 分钟，弃上清。

9.室温放置干燥或真空抽干 RNA 沉淀，大约晾 5-10 分钟即可，不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入 25-200μl 无 RNase 的水或0.5℅ SDS,用枪头吸打几次,55-60℃ 放置 10 分钟使 RNA 溶解，如 RNA 用于酶切反应,勿使用 SDS 溶液。RNA 也可用 100℅ 的去离子甲酰胺溶解，-70℃ 保存。

注意事项

1.从少量样品（1-10mg 组织或 102-104 细胞）中提取 RNA 时可加入少许糖原以促进 RNA 沉淀。例如加 800ml TRIzol 匀浆样品，沉淀 RNA 前加 5-10μg RNase-free 糖原。糖原会与 RNA 一同沉淀出来，糖原浓度不高于 4mg/ml 是不影响第一链的合成，也不影响 PCR 反应。

2．匀浆后加氯仿之前样品可以在 -60 至 -70℃ 保存至少一个月。RNA 沉淀可以保存于 75% 酒精中 2-8℃ 一星期以上或 -5 至 -20℃ 一年以上。

3．分层和 RNA 沉淀时也可使用台式离心机，2600×g 离心 30-60 分钟。

预期产量：1mg 组织或 1×106 细胞提取 RNA 分别为：

肝和脾 6-10μg ,肾 3-4μg ,骨骼肌和脑组织 1-1.5μg ,胎盘 1-4μg ,上皮细胞 8-15μg ,成纤维细胞 5-7μg 。

常见问题分析

得率低：

A.样品裂解或匀浆处理不彻底

B．RNA 沉淀未完全溶解

A260/A280<1.65 ：A.检测吸光度时，RNA 样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低 pH 值条件下 A280 值偏

B．样品匀浆时加的试剂量太少

C．匀浆样品时未在室温放置 5 分钟

D．吸取水相时混入了有机相

E．RNA 沉淀未完全溶解。

RNA 降解：

A.组织取出后没有马上处理或冷冻

B.待提取 RNA 的样品没有保存于 -60 至 -70℃,而保存在了 -5 至 -20℃

C.细胞在用胰酶处理时过度

D.溶液或离心管未经 RNase 去除处理

E.电泳时使用的甲醛 pH 值低于了 3.5

DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少

B.样品中含有有机溶剂(如乙醇, DMSO 等),强缓冲液或碱性溶液

蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加 0.25ml 异丙醇和 0.25ml 高盐溶液(0.8M 柠檬酸钠和 1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯 RNA。从含有大量多糖的植物中提取 RNA 时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。

二、DNA 的分离

准备试剂：乙醇 0.1M 柠檬酸钠(含10%乙醇) 75% 乙醇 8mM NaOH

操作步骤

1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的 DNA。每使用1ml TRIzo l加 0.3ml 无水乙醇混匀，室温放置 3 分钟，2-8℃ 不超过 2000×g 离心 5 分钟。

2. 移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含 10% 乙醇的 0.1M 柠檬酸钠洗涤 DNA 沉淀。每用 1ml TRIzol加入 1ml 柠檬酸钠，室温放置 30 分钟，2-8℃ 2000×g离心 5 分钟，弃上清，重复一次。

3. 用 75% 乙醇再洗一遍 DNA 沉淀，每用 1ml TRIzol 加入 1.5-2 ml 75% 乙醇,室温放置 10-20 分钟(不时颠倒混合) 2-8℃ 2000×g 离心 5 分钟, 弃上清。

4. 室温放置晾干 DNA 5-15分钟，用 8mM NaOH 溶解 DNA。从 50-70mg 组织或107细胞中分离的 DNA 溶于 300-600μl 8mM NaOH，DNA 的浓度通常为 0.2-0.3μg/μl 。提取的 DNA 沉淀不易溶于水和 Tris 缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaOH 的 pH 值为 9，溶解 DNA 后可用 TE，HEPES 调节 pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的 DNA 中可能包含一些胶状不溶物可 >12000×g 离心 10 分钟除去。

DNA 的定量：取一份溶于 8mM NaOH 的 DNA 加水测 A260 值。一单位 A260 值相当于50μg/ml 双链 DNA。根据 DNA 产量可估计细胞数，人，大鼠，小鼠 1×10 6二倍体细胞含 DNA 的量分别为 7.1 μg , 6.5 μg , 5.8 μg 。

预期产量：1mg 组织或 1×106 细胞提取 DNA 分别为肝和肾 3-4μg 骨骼肌，脑组织，胎盘 2-3μg 人，大鼠，小鼠培养细胞（1×106）5-7μg 成纤维细胞 5-7μg
应用：

1.用于 PCR 溶于 8mM NaOH 的 DNA 用 0.1M HEPES 调 pH 至 8.4,取 0.1-1μg DNA 用作模板。

2.酶切反应 用 HEPES 或 1mM EDTA 调节 pH 至适当值。每 μg DNA 使用 3-5 单位的酶，80-90% 的 DNA 是可消化的。

1ml 8mM NaOH 溶解的 DNA 样品 pH 值调节

Final pH 0.1M HEPES(μl) Final pH 1M HEPES(μl)

8.4 86 7.2 23

8.2 93 7.0 32

8.0 101

7.8 117

7.5 159

注意事项

1. DNA 在中间层和有机相中时可在 2-8℃ 保存过夜。

2. DNA 沉淀在 75% 乙醇中 2-8℃ 可保存几个月。

3. DNA 在 8mM NaOH 溶液中 4℃ 可放置过夜，如长期保存需用 HEPES 调节 pH 至 7-8 并且加 EDTA 至 1mM，可置于 4℃ 或 -20℃ 长期保存。

常见问题分析

得率低：

A.样品匀浆和裂解的不彻底

B.最终得到的 DNA 沉淀没有完全溶解

A260/A280<1.70 ：A. 检测吸光度时，RNA 样品没有溶于水，而溶于了 TE 中

B．酚除去的不彻底，可用0.1M 柠檬酸钠（含 10% 乙醇）再洗一遍 DNA 沉淀。

DNA 降解：

A.组织取出后没有马上处理或冷冻

B.待提取 RNA 的样品没有保存于 -60 至 -70℃,而保存在了 -5 至 -20℃

C．样品匀浆时使用了高速匀浆仪

RNA 污染：

A.氯仿分层后水相去除的不干净

B．DNA 沉淀用 0.1M 柠檬酸钠（含 10% 乙醇）洗的不彻底

三、蛋白质的提取

准备试剂：异丙醇 含0.3M 盐酸胍的 95% 乙醇 无水乙醇 1%SDS

操作步骤

1.取沉淀 DNA 后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用 1ml TRIzol 加 1.5ml 异丙醇，室温放置 10 分钟，2-8℃ 12000×g 离心 10 分钟弃上清。

2．用含 0.3M 盐酸胍的 95% 乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用 1ml TRIzol 加 2ml 洗涤液，室温放置 20 分钟，2-8℃ 7500×g 离心 5 分钟，弃上清，重复两次。用 2ml 无水乙醇同样方法再洗一次。

3．真空抽干蛋白质沉淀 5-10 分钟，用 1% SDS 溶解蛋白质，反复吸打，50℃ 温浴使其完全溶解，不溶物 2-8℃10000×g 离心 10 分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于 Western Blot 或 -5 至 -20℃ 保存备用。

注意事项

1.蛋白质沉淀可保存在含 0.3M 盐酸胍的 95% 乙醇或无水乙醇中 2-8℃ 一个月以上或 -5 至 -20℃ 一年以上。

2.用 0.1% SDS 在 2-8℃ 透析三次，10000×g 离心 10 分钟取上清即可用于Western Blot。

常见问题分析

得率低：

A.样品裂解或匀浆处理不彻底

B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解

蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻

电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分