位点特异性核酸内切酶的蛋白质工程
丁香园
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1. 介绍
类型 Ⅱ 限制性内切核酸酶是定点切割 DNA 不可或缺的工具。它们通常识别长度在 4~8 个 bp ( 碱基对）的双链 DNA 序列。在 Mg2+ 存在的条件下，它们在识别位点内或紧靠识别位点的地方切断 DNA 双链，以产生带有 5'-磷酸和 3'-羟基的平末端或黏末端 ( 见参考文献 [ 1 ] 的述评）。限制性酶属于已知最具特异性的酶：对只差一个碱基对的序列的切割比对正常识别序列的切割要慢 106 倍。这种极端的精确性来自于直接阅读 (与碱基相互作用）和间接阅读（与糖- 磷酸骨架相互作用）的密切配合。典型地，在限制性酶和识别序列的碱基之间，除了无数与碱基接触形成的范德华力，和有些是靠水做中介的与骨架作用形成的氢键外，还形成了 15~20 个氢键。这意味着识别是多因素决定的和冗余的。因而，通过理性蛋白设计来改变限制性酶的特异性，由于这些原因而不容易成功。因为必须一次改变几个接触，并替换一个以上的氨基酸残基 [2]。而且，在大多数限制性酶中，涉及识别的氨基酸残基位于很接近负责催化的残基位点。虽然这保证了识别与催化的紧密耦合，但一直是蛋白质工程的大障碍（见参考文献 [ 3 ] 的述评），因而回顾起来并不奇怪，理性蛋白设计并未做到真正的特异性改变 [4] ，无论是在试管中 [5，6] ，还是在体内[ 7，8] ，研究者已转向用进化方法来改变限制性酶的特异性。但是即使使用这些方法，至今仅有特异性减少（如 Bsty l，从 RGATCY 到更优的 AGATCT，参考文献 [7] )，或特异性扩展（ 如 Eco571，从 CTGAAG 到 CTGRAG，参考文献 [ 8 ] ) 可以实现。这很可能是因为限制性酶在结构上没有足够的可变性，并且，为实现真正的特异性改变，需要多个氨基酸替换。这可能是一种保障，以防止不期望的、多数情况下是有害的、主基因组被限制性酶变体切除。而这些变体在翻译过程中在小范围内总是被制造出来。通过同样的论证，可以预料，可能产生特性改变了的限制性酶变体，并且这些特性在进化中没有受到负选择。事实上，可以制造出含有简单氨基酸替换的 EcoRI 和 EcoRV 变体。这些变体可以比野生型酶更好地切除含有修饰碱基的 DNA 序列（EcoRI Q115，参考文献 [9]；EcoRV N188，参考文献 [ 10 ] ) 或骨架被修饰（ECORV T94V，参考文献 [ 11 ] ) 的 DNA。
这里，我们报告一个与限制性酶相关的酶，即来自于大肠杆菌的错配修复蛋白 MutH 通过单氨基酸替换，怎样被转变为放宽了特异性的变体。使用过的操作步骤，在此得到详细描述，应该适合于广泛应用。首先，介绍了被研究的体系（见 7.1.1)，同时还交代了结构上的考虑，以选择恰当的氨基酸替换，使特异性得到期望的变化（见 7.1.2)。
1.1 DNA 错配修复蛋白 MutH
在几乎所有有机体中，DNA 错配修复对纠正复制中的错误，都是最重要的过程之一；它使复制保真度提高了 1000 倍（见参考文献 [ 12 ] 的述评）。在大肠杆菌中，DNA 错配修复由 MutS 结合于错配位点引发，接着是 MutH 依赖于 MutL 的激活。激活的 MutH 在半甲基化的 d (GATC) 位点切开未甲基化的（即刚复制的）链 。这个位点可能在错配位点的上游或下游几百个碱基对处。切开的 DNA 链在螺旋酶 Ⅱ 的协助下，被四个核酸外切酶之一以外切方式降解，直到并超过错配位点。被移除的片段随后被 DNA 聚合酶 Ⅲ 和 DNA 连接酶合成新片段取代（和修复）。
MutH 是序列特异的 Mg2+ 依赖的 DNA 内切核酸酶，分子质量为 28 kDa。它与类型 II 限制性内切核酸酶 SaM3AI 有序列相似性 [ 13 ]。Saw3AI 也识别 d ( GATC) 序列，并在 G 的 5' 端切开。但是，MutH 只切割未被甲基化的链，无论是在半甲基化的或是在未甲基化的 DNA 中；而 Saw3AI 不管 DNA 是否处于甲基化状态两条链都切割。与典型的限制性内切核酸酶和 Sau3AI 都不同，MutH 作为单体是活性的 MutH 结构的确定（见参考文献 [ 14 ] 和 [ 15 ] ) 证实了 MutH 和类型 H 限制性内切核酸酶 PD...D/EXK 家族间的关系。基于 MutH 和 PvuⅡ [ 16，17 ] 间的结构同源性，通过单体 Mut H 与齐二聚 Pvu Ⅱ 的一个亚单位的叠合，鉴别出了 MutH 的假设的 DNA 结合和活性位点 [13] 由 Asp70、Glu77 和 Lys79，以及其他残基组成 [ 18~21] 。
1.2 MutH 中涉及感知 DNA 的 d (GATC) 位点甲基化状态的候选氨基酸残基的鉴别
我们使用了两个来源的信息以鉴别 MutH 中的那些氨基酸残基，它们作为可能的候选者，用来感知 d (GATC) 位点的甲基化状态，即一条链上，甲基在腺嘌呤 N6 上存在，而在另一条链上则不存在这样的甲基。
已知在大肠杆菌、流感嗜血杆菌、霍乱弧菌、ShewaneWaoweWensis 和 CoZweZZzasp. 中都鉴定出了 MutH 蛋白；有可能在这些高度同源的蛋白质中，那些负责感知 d (GATC) 位甲基化状态的氨基酸残基是保守的。MutH 与限制性酶，如来自于金黄色葡萄球菌的 Sau3AI 存在序列相似性。与 MutH 相似，这些酶识别 d (GATC) 位点。与不切割甲基化 DNA ( 半甲基化的 DNA 只有未甲基化的链上被切开）的 MutH 不同，这些酶在未甲基化、半甲基化和全甲基化的 DNA 的两条链上都切割。MutH 酶和限制性酶序列的逐点比较，应该使得两个家族的蛋白氨基酸残基的鉴别对序列识别同等重要，以及只应在 MutH 蛋白中存在感知甲基化状态所需要的残基。
蛋白质氨基酸序列的比对证明这些核酸酶共享许多保守的氨基酸残基，由此可以推测这些保守残基都涉及共同的功能，包括 DNA 结合、识别和剪切。某些氨基酸残基只在 MutH 蛋白中保守，其中有 Phe94、Arg184 和 Tyr212 ( 图 7.1)。为说明这些氨基酸残基中的哪些有可能位于蛋白质-DNA 界面上，用催化中心的残基作为参考点，我们把 MutH 的结构叠加到限制性-DNA 复合物结构之上。在重叠的结构中，下列残基接近对应于 DNA 序列双链中的腺嘌呤残基的核酸碱基：Lys48 面对小沟，Phe94、Arg184 和 Tyr212 面对大沟（图 7.2)。因为腺嘌呤残基的秘位于大沟，只有 Phe94、Arg184 和 Tyr212 是好的候选残基，它们可用于感知一条链中的 N6 的甲基化和另一条链 N6 的未甲基化。Tyr212 似乎特别地引人注目，因为叠加结果显示其位置接近两条链中的腺嘌呤残基。
1.3 MutH 的 DNA 切口和切割活性分析
MutH 和 MutH 变体在 DNA 切口和切割中的活性和特异性的分析，最好用含有单个未甲基化、半甲基化和全甲基化 d (GATC) 位点的双链 DNA 作为底物来研究。为探测两条链中磷酿键的切割，DNA 底物的两条链应带有不同的标记。这样的底物可以用荧光标记引物进行聚合酶链反应（PCR) 来制备。在 d (GATC) 位点甲基的引入需要 dam 甲基化酶做酶性甲基化。通过 λ 外切酶降解全甲基化底物的两条甲基化链中的一条，并与一条互补的未被甲基化的链杂交，就得到半甲基化的底物。对这些底物与 MutH 保育后的切割产物的分析，可以很容易地用带有激光诱导荧光探测的变性聚丙烯酰胺毛细管电泳来实行 [ 19，22] 。
2. 材料
2.1 DNA 结合和识别残基的鉴别
以下计算程序是用来鉴别 MutH 涉及感知 d ( GATC) 位点甲基化状态的残基。
( 1 ) ClustaW ( http ： //www. ebi. ac . uk/clustalw / )。
( 2 ) ClustalX ( http : //bips. u- strasbg.fr /fr /Documentation/C lustalX/ ；请注意，网址有大小写区别）。
( 3 ) GeneDoc ( http ： //ww w.psc.edu/biomed/genedoc/ )。
( 4 ) RasMol (http： //www. openrasmol. org/ )。
( 5 ) Swiss PDB Viewer (http ： //www. expasy. org/spdbv/ )。
2.2 MutH 的定点突变
( 1 ) pMQ402——BAD18 的一种衍生物，用作细菌表达质粒 [23] 。在诱导蛋白质表达的阿拉伯糖启动子的控制之下，它含有用 His 标记的 MutH 蛋白的编码序列。表达出的蛋白质可用 Ni-次氮基三乙酸（NTA ) 琼脂糖亲和柱纯化。质粒含有供筛选的氨苄青霉素抗性基因。
( 2 ) PCR 引物，用于定点突变。
( 3 ) pfu 聚合酶。
( 4 ) 三磷酸脱氧核糖核苷。
2.3 过表达、纯化和鉴定
( 1 ) Luria-Bemni ( LB ) 培养基（每升）：10 g 菌用胰蛋白胨，5 g 菌用酵母抽提物和 5 g 氯化钠。用氢氧化钠调节 pH 至 7.2~7.5，并灭菌。
( 2 ) 阿拉伯糖（Sigma)。
( 3 ) 苯甲基磺酰氟（PMSF) ( Merck)。
( 4) Ni-NTA 琼脂糖（Qiagen)。
( 5 ) 大肠杆菌菌株 XL-1 Blue MRF'（Stratagene)。
( 6 ) 超声破碎器。
( 7 ) 冷冻离心机。
( 8 ) 空柱（BioRad)。
( 9 ) 结合缓冲液：20 mmol/L Tris- 氯化氢、5 mmol/L 咪唑、1 mol/L 氯化钠和 1 mmol/L PMSF，pH 7.9。
( 10 ) 清洗缓冲液：20 mmol/L Tris-氯化氢、60 mmol/L 咪唑、1 mol/L 氯化钠和 1 mmol/L PMSF，pH 7.9。
( 11 ) 洗脱缓冲液：20 mmol/L Tris-氯化氢、200 mmol/L 咪唑、1 mol/L 氯化钠和 1 mmol/L PMSF，pH 7.9。
( 12 ) 透析缓冲液：10 mmol/L HEPES-氢氧化钾、100 mmol/L 氯化钾、1 mmol/L EDTA 和 1 mmol/L 二硫苏糖醇，pH 7.9。
( 13 ) 透析缓冲液 G：10 mmol/L HEPES-氢氧化钾、100 mmol/L 氯化钾、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L 二硫苏糖醇和 50% 甘油，pH 7.9。
2.4 内切酶活性测试
( 1 ) 测试缓冲液：10 mmol/L Tris-氯化氢，pH 7.5、10 mmol/L 氯化镁、0.75 mmol/L 三磷酸腺苷和 0.1 mg/ml 牛血清白蛋白。
( 2 ) 大肠杆菌 MutL 蛋白。
( 3 ) 荧光团标记的寡核苷酸或荧光标记的 PCR 产物 [ 模板 DNA、磷酸化引物、荧光团标记引物、dam 甲基化酶（NEB)、λ-外切酶（NEB)、外切酶 I (NEB)、PCR 自旋柱（Qiagen) 和 pfu DNA 聚合酶（Promega) ] 。
( 4 ) 模板抑制剂（Perkin- Elmer)。
( 5 ) GeneScan-500 TAMRA DNA 分子质量标准（Perkin- Elmer)。
( 6 ) ABI PRISM 310 基因分析仪（Perkin- Elmer)。
( 7 ) 灌有加了 8 mol/L 尿素的 POP-4 聚合物的 47 cm 毛细管（内径：50 μm ) (Perkin- Elmer)。
( 8 ) 加有 1 mmol/L EDTA 的 1X 基因分析缓冲液（Perkin- Elmer)。
4. 注
1. 通过在 “ Edit Sequence Groups” 对话框中设置 “ Group Cons Level” 和 “ PCR Maximum Level” 可以改变图像阴影。
2. —个引物会导致期望的突变，而另一个为反义引物，以生成所谓“ megaprimer” 用于定点突变（据 QuikChange操作规程）。
3. 诱导的时间和温度取决于被研究的体系。
4. 某些情况下，需切除 His 标记。此处使用的建构允许在 His 标记和 N 端甲硫氨酸间的凝血酶位点做切割。
5. 与用 MutL 活化不同的另一种方法是，加入 10% ( V/V ) 二甲基亚砜，可使 MutH 内切酶活性激活到 10 倍。
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这里，我们报告一个与限制性酶相关的酶，即来自于大肠杆菌的错配修复蛋白 MutH 通过单氨基酸替换，怎样被转变为放宽了特异性的变体。使用过的操作步骤，在此得到详细描述，应该适合于广泛应用。首先，介绍了被研究的体系（见 7.1.1)，同时还交代了结构上的考虑，以选择恰当的氨基酸替换，使特异性得到期望的变化（见 7.1.2)。
1.1 DNA 错配修复蛋白 MutH
在几乎所有有机体中，DNA 错配修复对纠正复制中的错误，都是最重要的过程之一；它使复制保真度提高了 1000 倍（见参考文献 [ 12 ] 的述评）。在大肠杆菌中，DNA 错配修复由 MutS 结合于错配位点引发，接着是 MutH 依赖于 MutL 的激活。激活的 MutH 在半甲基化的 d (GATC) 位点切开未甲基化的（即刚复制的）链 。这个位点可能在错配位点的上游或下游几百个碱基对处。切开的 DNA 链在螺旋酶 Ⅱ 的协助下，被四个核酸外切酶之一以外切方式降解，直到并超过错配位点。被移除的片段随后被 DNA 聚合酶 Ⅲ 和 DNA 连接酶合成新片段取代（和修复）。
MutH 是序列特异的 Mg2+ 依赖的 DNA 内切核酸酶，分子质量为 28 kDa。它与类型 II 限制性内切核酸酶 SaM3AI 有序列相似性 [ 13 ]。Saw3AI 也识别 d ( GATC) 序列，并在 G 的 5' 端切开。但是，MutH 只切割未被甲基化的链，无论是在半甲基化的或是在未甲基化的 DNA 中；而 Saw3AI 不管 DNA 是否处于甲基化状态两条链都切割。与典型的限制性内切核酸酶和 Sau3AI 都不同，MutH 作为单体是活性的 MutH 结构的确定（见参考文献 [ 14 ] 和 [ 15 ] ) 证实了 MutH 和类型 H 限制性内切核酸酶 PD...D/EXK 家族间的关系。基于 MutH 和 PvuⅡ [ 16，17 ] 间的结构同源性，通过单体 Mut H 与齐二聚 Pvu Ⅱ 的一个亚单位的叠合，鉴别出了 MutH 的假设的 DNA 结合和活性位点 [13] 由 Asp70、Glu77 和 Lys79，以及其他残基组成 [ 18~21] 。
1.2 MutH 中涉及感知 DNA 的 d (GATC) 位点甲基化状态的候选氨基酸残基的鉴别
我们使用了两个来源的信息以鉴别 MutH 中的那些氨基酸残基，它们作为可能的候选者，用来感知 d (GATC) 位点的甲基化状态，即一条链上，甲基在腺嘌呤 N6 上存在，而在另一条链上则不存在这样的甲基。
已知在大肠杆菌、流感嗜血杆菌、霍乱弧菌、ShewaneWaoweWensis 和 CoZweZZzasp. 中都鉴定出了 MutH 蛋白；有可能在这些高度同源的蛋白质中，那些负责感知 d (GATC) 位甲基化状态的氨基酸残基是保守的。MutH 与限制性酶，如来自于金黄色葡萄球菌的 Sau3AI 存在序列相似性。与 MutH 相似，这些酶识别 d (GATC) 位点。与不切割甲基化 DNA ( 半甲基化的 DNA 只有未甲基化的链上被切开）的 MutH 不同，这些酶在未甲基化、半甲基化和全甲基化的 DNA 的两条链上都切割。MutH 酶和限制性酶序列的逐点比较，应该使得两个家族的蛋白氨基酸残基的鉴别对序列识别同等重要，以及只应在 MutH 蛋白中存在感知甲基化状态所需要的残基。
蛋白质氨基酸序列的比对证明这些核酸酶共享许多保守的氨基酸残基，由此可以推测这些保守残基都涉及共同的功能，包括 DNA 结合、识别和剪切。某些氨基酸残基只在 MutH 蛋白中保守，其中有 Phe94、Arg184 和 Tyr212 ( 图 7.1)。为说明这些氨基酸残基中的哪些有可能位于蛋白质-DNA 界面上，用催化中心的残基作为参考点，我们把 MutH 的结构叠加到限制性-DNA 复合物结构之上。在重叠的结构中，下列残基接近对应于 DNA 序列双链中的腺嘌呤残基的核酸碱基：Lys48 面对小沟，Phe94、Arg184 和 Tyr212 面对大沟（图 7.2)。因为腺嘌呤残基的秘位于大沟，只有 Phe94、Arg184 和 Tyr212 是好的候选残基，它们可用于感知一条链中的 N6 的甲基化和另一条链 N6 的未甲基化。Tyr212 似乎特别地引人注目，因为叠加结果显示其位置接近两条链中的腺嘌呤残基。
1.3 MutH 的 DNA 切口和切割活性分析
MutH 和 MutH 变体在 DNA 切口和切割中的活性和特异性的分析，最好用含有单个未甲基化、半甲基化和全甲基化 d (GATC) 位点的双链 DNA 作为底物来研究。为探测两条链中磷酿键的切割，DNA 底物的两条链应带有不同的标记。这样的底物可以用荧光标记引物进行聚合酶链反应（PCR) 来制备。在 d (GATC) 位点甲基的引入需要 dam 甲基化酶做酶性甲基化。通过 λ 外切酶降解全甲基化底物的两条甲基化链中的一条，并与一条互补的未被甲基化的链杂交，就得到半甲基化的底物。对这些底物与 MutH 保育后的切割产物的分析，可以很容易地用带有激光诱导荧光探测的变性聚丙烯酰胺毛细管电泳来实行 [ 19，22] 。
2. 材料
2.1 DNA 结合和识别残基的鉴别
以下计算程序是用来鉴别 MutH 涉及感知 d ( GATC) 位点甲基化状态的残基。
( 1 ) ClustaW ( http ： //www. ebi. ac . uk/clustalw / )。
( 2 ) ClustalX ( http : //bips. u- strasbg.fr /fr /Documentation/C lustalX/ ；请注意，网址有大小写区别）。
( 3 ) GeneDoc ( http ： //ww w.psc.edu/biomed/genedoc/ )。
( 4 ) RasMol (http： //www. openrasmol. org/ )。
( 5 ) Swiss PDB Viewer (http ： //www. expasy. org/spdbv/ )。
2.2 MutH 的定点突变
( 1 ) pMQ402——BAD18 的一种衍生物，用作细菌表达质粒 [23] 。在诱导蛋白质表达的阿拉伯糖启动子的控制之下，它含有用 His 标记的 MutH 蛋白的编码序列。表达出的蛋白质可用 Ni-次氮基三乙酸（NTA ) 琼脂糖亲和柱纯化。质粒含有供筛选的氨苄青霉素抗性基因。
( 2 ) PCR 引物，用于定点突变。
( 3 ) pfu 聚合酶。
( 4 ) 三磷酸脱氧核糖核苷。
2.3 过表达、纯化和鉴定
( 1 ) Luria-Bemni ( LB ) 培养基（每升）：10 g 菌用胰蛋白胨，5 g 菌用酵母抽提物和 5 g 氯化钠。用氢氧化钠调节 pH 至 7.2~7.5，并灭菌。
( 2 ) 阿拉伯糖（Sigma)。
( 3 ) 苯甲基磺酰氟（PMSF) ( Merck)。
( 4) Ni-NTA 琼脂糖（Qiagen)。
( 5 ) 大肠杆菌菌株 XL-1 Blue MRF'（Stratagene)。
( 6 ) 超声破碎器。
( 7 ) 冷冻离心机。
( 8 ) 空柱（BioRad)。
( 9 ) 结合缓冲液：20 mmol/L Tris- 氯化氢、5 mmol/L 咪唑、1 mol/L 氯化钠和 1 mmol/L PMSF，pH 7.9。
( 10 ) 清洗缓冲液：20 mmol/L Tris-氯化氢、60 mmol/L 咪唑、1 mol/L 氯化钠和 1 mmol/L PMSF，pH 7.9。
( 11 ) 洗脱缓冲液：20 mmol/L Tris-氯化氢、200 mmol/L 咪唑、1 mol/L 氯化钠和 1 mmol/L PMSF，pH 7.9。
( 12 ) 透析缓冲液：10 mmol/L HEPES-氢氧化钾、100 mmol/L 氯化钾、1 mmol/L EDTA 和 1 mmol/L 二硫苏糖醇，pH 7.9。
( 13 ) 透析缓冲液 G：10 mmol/L HEPES-氢氧化钾、100 mmol/L 氯化钾、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L 二硫苏糖醇和 50% 甘油，pH 7.9。
2.4 内切酶活性测试
( 1 ) 测试缓冲液：10 mmol/L Tris-氯化氢，pH 7.5、10 mmol/L 氯化镁、0.75 mmol/L 三磷酸腺苷和 0.1 mg/ml 牛血清白蛋白。
( 2 ) 大肠杆菌 MutL 蛋白。
( 3 ) 荧光团标记的寡核苷酸或荧光标记的 PCR 产物 [ 模板 DNA、磷酸化引物、荧光团标记引物、dam 甲基化酶（NEB)、λ-外切酶（NEB)、外切酶 I (NEB)、PCR 自旋柱（Qiagen) 和 pfu DNA 聚合酶（Promega) ] 。
( 4 ) 模板抑制剂（Perkin- Elmer)。
( 5 ) GeneScan-500 TAMRA DNA 分子质量标准（Perkin- Elmer)。
( 6 ) ABI PRISM 310 基因分析仪（Perkin- Elmer)。
( 7 ) 灌有加了 8 mol/L 尿素的 POP-4 聚合物的 47 cm 毛细管（内径：50 μm ) (Perkin- Elmer)。
( 8 ) 加有 1 mmol/L EDTA 的 1X 基因分析缓冲液（Perkin- Elmer)。
4. 注
1. 通过在 “ Edit Sequence Groups” 对话框中设置 “ Group Cons Level” 和 “ PCR Maximum Level” 可以改变图像阴影。
2. —个引物会导致期望的突变，而另一个为反义引物，以生成所谓“ megaprimer” 用于定点突变（据 QuikChange操作规程）。
3. 诱导的时间和温度取决于被研究的体系。
4. 某些情况下，需切除 His 标记。此处使用的建构允许在 His 标记和 N 端甲硫氨酸间的凝血酶位点做切割。
5. 与用 MutL 活化不同的另一种方法是，加入 10% ( V/V ) 二甲基亚砜，可使 MutH 内切酶活性激活到 10 倍。
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