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    方案9 用 GFP 嵌合体监控蛋白质-蛋白质相互作用实验

    相关实验：蛋白质复合体性质的研究

    最新修订时间：

    材料与仪器

    纯化的目标蛋白 纯化的 S65T GFP 嵌合体
    非变性聚丙稀醜胺凝胶 Tris-HCl 缓冲液
    荧光成像系统 垂直胶板电泳系统

    步骤

    方法 1 荧光凝胶阻滞分析法


    2 0 个 氨 基 酸 残 基 ） 和 S-蛋 白 （21 〜 1 2 4 个 氨 基 酸 残 基 ） （R ich ard s， 1955)。 S 肽 段 的 1〜 I 5 个 氨 基 酸 残 基 （ S15) 足 以 、也 必 须 与 S 蛋 白 形 成 复 合 体 （ P o tts , e t a l , 1963 ) 。 荧光凝胶阻滞分析法，用于定量分析S 蛋 白 与 S15之间的相互作用。使用标准的 D N A 重组技术构建G F P 嵌合体： S15-GFP (S65T )-H 1S6，并使用Ni2+-亲 和层析法进行 纯 化 （ ParkandRainse, 1997， 2000)。一 定量的 S15〜 G F P (S65T ) 〜 Hiss 与不同剂量 的 S 蛋白混合孵育后，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，用荧光成像系 统观察凝胶，从而得出结合的和游离的 S15〜 G F P (S65T ) 〜 His6 的 荧 光 强 度 （ 图 10.31， 顶部）。 在不同浓度S 蛋白存在情况下，形成的复合体K d 值 ，可以由i? 值 和 S 蛋白、 S15〜 G F P (S65T )〜 His6 的总浓度计算出来（ 方 程 1)， K d 的 平 均 （ 士SE) 值为 (6士3) X 10_8mol/L 。 研 究 S15〜G F P (S65T )〜His6 和 S 蛋白之间相互作用的特异性的一种竞争性分析 法。将 S15〜G F P (S65T )〜His6 与 S 蛋白混合孵育，以形成复合体，改变加入S 肽段 的量，混合物继续孵育20min，而后进行非变性凝胶电泳， S 肽段的加人使结合的S15〜 G F P (S65T )〜His6 转变为游离状态（ 图 10.31，底端）。因此， S15〜G F P (S65T )〜 H 1S6 和 S 肽段是与S 蛋白的同一区域结合。

    方法 2 荧光极性分析法

    ① 用 I m l 20m m o l / L (p H 8 .0 ) 的 Tris-H C l 缓 冲 液 （ 含 或 不 含 NaCl) 溶解不同 量的 Y ，在 20°C 与 0. 5〜l.Onmol/L X 〜G F P (S65T ) 混合。 采用不同的条件，如缓冲液、 p H 、温度和盐，来检测它们对结合作 用的影响。 ② 混合后，立即用可测定极性的荧光光度计，对每种 Y 浓度的混合液做5〜7 个 极性的检测，用 无 X 〜G F P (S65T ) 的各组分混合液作为空白对照。突 光 极 性 （ p>) 定 义 为 : P= ( Lz - U )Z (Izz - U)O (1〇_2) 式中， 为与激发光与发射光平行时的荧光强度， 为与二者相垂直时的突光 强度， P 是荧光强度的比值，是一个无因次数字，且最大值为0.5。 ③ 用 相 应 软 件 （ 如 DetaGraph) 算 出 K d 值 ，将数据代人方程： P = A P • F / ( K d + F ) + P min Q o -3) 式中， P 为算出的极性值， A P (= P max —P min) 为极性值总变化量， F 为 游 离
    的 浓 度 。结 合 蛋 白 比 例 （/B) 可由以下方程算出： /B = ( P - P min)/A P = F /( K ^ + F ) (10-4) 以 / b 对 F 作 图 可 得 蛋 白 结 合 曲 线 。 实例研究： 荧光极性 这里采用荧 光极 性法，分 析 盐 浓 度 对 S 蛋 白 和 S15-G FP (S65T )-H is6 之间形成复 合 体 的 影 响 。当 N a C l的 终 浓 度 达 到 〇.l 〇 m 〇 l/L 时 ， K d 值 增 加 到 原 来 的 4 倍 （ 见图 10. 32)。 以 前 对 盐 浓 度 影 响 R N ase S 的 解 离 也 有 相 似 的 报 道 （ Schreier and B aldw in， 1977)。加 人 盐 后 ，有 可 能 阻 碍 水 分 子 与 处 于 s 肽 段 和 3 蛋 白 之间的疏水片 段发生水合 反 应 ，从 而 降 低 了 结 合 的 亲 和 力 （ B aldw in， 1996)。 最 后 ，在 含 NaCl (0.10mol/L ) 的 20m m d ./L T ris-H C l 缓 冲 液 （ PH 8 _ 0 ) 中 ，测出的 K d 值为 4 . 2 X 10— 8m o l/L ，与在含 NaCl (O.lOmol/L ) 的 50m m o l/L 乙 酸 钠 缓 冲 液 （ p H 6. 0) 中 测 出 的 相 似 （ 即减小到原 来的 1/3) (Connelly, e t a l ， 1990)。

    ​

    来源：丁香实验

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