蛋白质的性质与鉴定

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蛋白质(protein)是生命的物质基础，是生物体最重要的生物大分子 之一，所有的生命活动都离不开蛋白质。对蛋白质的结构、性质和功能的研究是生命科学的核心问题。认识蛋白质要首先从了解蛋白质的性质入手，并进一步掌握利用蛋白质的性质对样品中的蛋白质进行鉴定和分离的技术。本实验主要介绍对样品中是否含有蛋白质进行定性鉴定以及蛋白质沉淀分离的基本方法。

一、蛋白质的呈色反应
蛋白质的呈色反应是指利用蛋白质的结构 或某些特殊基团的化学性质，与一些化学试剂发生反应，生成有色物质而呈现不同颜色的反应。不同的蛋白质结构不同，其氨基酸的种类和含量也不同，因此其呈色反应的特征也不同。利用蛋白质呈色反应的强度和特征的差异，可对蛋白质进行定性和定量分析。
【实验目的】
 学习和了解常用的几种鉴定蛋白质与氨基酸的方法，进一步认识氨基酸是蛋白质的基本结构单位。
【实验内容】
（一）双缩脲反应
【实验原理】
当加热至 180℃左右时，两分子尿素缩合脱去一分子氨，生成双缩脲。

双缩脲反应是指在碱性条件下，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用，生成紫红色配合物的反应。在肽和蛋白质分子中具有肽键(-CO-NH-)，其结构与双缩脲类似，也能发生此反应，生成蓝紫色或紫红色的配合物，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故常用于蛋白质的定性或定量测定。
凡分子中含二个或二个以上酰胺基(-CO-NH2)，或与此相似的基团，如-CH2-NH2，-CS-NH2，-C(NH)NH2的任何化合物，无论这类基团直接相连，还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应，并且该反应的干扰因素较多。NH3对此反应具有严重的干扰，因为NH3与铜离子可生成深蓝色的铜氨配合物。应当注意，蛋白质和多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
【器材和试剂】
1. 器材 酒精灯，试管等。
2. 试剂
（1）1∶10鸡蛋白溶液。
（2）10%NaOH溶液。
（3）1％CuSO4。
（4）尿素。
【操作步骤】
1．取小试管一支，加1∶10鸡蛋白液2滴、10％NaOH溶液5滴及1％硫酸铜溶液1滴，混匀后，呈紫红色的双缩脲反应。
2．另取小试管1支，加小匙尿素，小火加热至熔，试嗅其气味。继续加热使之凝固，这固体是什么？加水15滴使熔，然后加10％NaOH 5滴，1％硫酸铜1滴，可见什么现象？
（二）茚三酮反应
【实验原理】
凡含有自由氨基的化合物与茚三酮共热时，可生成蓝紫色物质，此反应茚三酮反应。伯氨化合物、NH3和α-氨基酸及一切蛋白质能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。但脯氨酸、羟脯氨酸氧化时不能放出NH3和茚三酮反应生成黄色物质。在定性或定量测定生物样品中的α-氨基酸及蛋白质时，应严防伯氨化合物和能释放出NH3的干扰物的存在。
α-氨基酸及蛋白质的茚三酮反应分二步进行，首先是氨基酸被氧化，产生 CO2和醛，而水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所生成之还原型茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为5～7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能显示反应，因此是一种常用的氨基酸定量方法。


【器材和试剂】
1．1∶10鸡蛋白溶液
2．0.1%茚三酮乙醇溶液
3．0.25%丙氨酸溶液：称取丙氨酸0.25g，加水100ml
【操作步骤】
1．取小试管1只，加1∶10鸡蛋白溶液4滴、蒸馏水10滴、0.1％茚三酮乙醇溶液6滴，混匀，于沸水浴中加热约1min，室温冷却后，即成粉红色，以后慢慢变成紫色或蓝色。
2．取小试管1支，加丙氨酸4滴重复上述操作，观察结果。

二、蛋白质的沉淀反应
亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即同种电荷和溶剂化膜。蛋白质是高分子化合物，其分子大小在1～100nm，蛋白质分子的-COOH、-NH2和-OH都是亲水基团，因此，蛋白质是亲水胶体。蛋白质在体液中的稳定存在对生物非常重要。 在水溶液中，蛋白质表面的亲水基团与极性水分子相互作用形成水化膜，同时蛋白质分子本身带有电荷，与溶液的反离子作用，形成双电层，削弱了蛋白质分子之间的吸附力，因而每个蛋白质分子可形成一个稳定的胶粒。整个蛋白质溶液就形成稳定的亲水溶胶体系。蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。
在一定物理化学因素影响下，蛋白质分子失去水化膜或失去电荷，就丧失了稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀作用。
沉淀法操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。根据沉淀作用的结果，可将蛋白质的沉淀作用分为两类：
（1）可逆沉淀作用：在发生沉淀作用时，虽然蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变，仍保持原有的结构和性质。如除去沉淀因素，蛋白质可重新溶解。因此，这种沉淀作用称为可逆沉淀作用。属于此类的有盐析作用，低温下丙酮、乙醇使蛋白质沉淀的作用，以及利用等电点的沉淀等。
（2）不可逆沉淀作用：在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构型遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中，称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
【实验目的】
1. 通过实验加深对蛋白质溶液的溶胶特性及其稳定因素的认识。
2. 了解各种沉淀试剂使蛋白质沉淀的本质，区分可逆的盐析沉淀及不可逆的沉淀作用。
【实验内容】
(一)蛋白质的盐析作用
【实验原理】
　用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用或中性盐沉淀。
蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭受破坏而沉淀析出。中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，析出的蛋白质仍保持其天然蛋白的性质，若除去中性盐或减低盐的浓度时，还能重新溶解。
沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同，而盐类不同也有差异。例如：加硫酸铵至饱和，则清蛋白沉淀析出；加硫酸铵至半饱和，则球蛋白沉淀析出。向含有清蛋白和球蛋白的鸡蛋清溶液中加硫酸镁或氯化钠至饱和，则球蛋白沉淀析出。所以在不同条件下，用不同浓度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，该法称为蛋白质的分级盐析。目前，蛋白质的盐析作用在各种蛋白质和酶的分离纯化、生产、科研工作和临床化验等工作中广泛应用。
【器材和试剂】
1．1∶10鸡蛋白溶液。
2．饱和硫酸铵溶液：称取377g硫酸氨溶于500ml 20℃的水中。可称取过量的硫酸氨，加热助溶，冷却后，应有晶体析出。
3．固体硫酸铵
【操作步骤】
1．取5ml鸡蛋白溶液于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，混匀，静置20min后，则球蛋白全部析出。
2．过滤，收集透明滤液，滤液中含有清蛋白，若滤液浑浊，须继续过滤至透明为止。
3．向1ml清滤液中加固体硫酸铵约0.5g，边加边振摇，直至达到饱和，溶液出现浑浊，再向浑浊液加1.5～2.0ml水，观察结果。
（二）生物碱试剂沉淀蛋白质
【实验原理】
植物 体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱 (或植物碱)。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，蛋白质溶液的pH值小于等电点时，蛋白质分子的碱性基团带有较多的正电荷，它能与生物碱试剂中的负电荷结合形成不溶物而沉淀。生物碱试剂以及三氯乙酸、磺基水杨酸，在血液与尿液分析时都很重要，进行血液化学成分滴定时，常用作去除蛋白质的试剂，以消除蛋白质对测定的干扰。
【器材和试剂】
1．1∶10鸡蛋白溶液。
2．10%HCl溶液。
3．10%NaOH溶液。
4．10%磺基水杨酸溶液。
【操作步骤】
（1）取试管1支，加入1∶10鸡蛋白溶液1ml、10%HCl1滴，混匀，再加入10％磺基水杨酸溶液2滴。
（2）另观察两管蛋白质的沉淀。
（三）重金属盐沉淀蛋白质
【实验原理】
蛋白质溶液的pH值大于等电点时，蛋白质分子的酸性基团带有较多的负电荷，易与带正电荷的重金属盐类Cu２＋ 、Ag＋ 、Pb２＋ 和Hg２＋ 等结合成稳定的沉淀而析出。
在有机体内，蛋白质常以其可溶性的钠盐或钾盐的形式存在；当加入汞、铅、铜、银等重金属盐时；则蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀。经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解于水中，说明它已发生了变性。
重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质；临床上用蛋白质解除重金属盐的食物性中毒。但应注意，使用乙酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过量，否则可使沉淀出的蛋白质重新溶解。
【器材和试剂】
1．1∶10鸡蛋白溶液。
2．10%NaOH溶液。
3．0.5％硫酸锌溶液。
4．3％硝酸银溶液。
5．0.5％乙酸铅溶液。
6．0.1％硫酸铜溶液。
【操作步骤】
1．取1支试管，加入1∶10鸡蛋白溶液1ml、10%NaOH 1滴，混匀，再加入0.5％硫酸锌6滴，观察结果。0.5％乙酸铅
2．取试管3支，各加入约1m1蛋白质溶液，分别加入3％硝酸银3～4滴，0.5％乙酸铅1～3滴和0.1％硫酸铜3～4滴，观察沉淀的生成。第1支试管的沉淀留作透析用，然后向第2、3支试管再分别加人过量的乙酸铅和饱和硫酸铜溶液，观察沉淀的再溶解。
（四）加热沉淀蛋白质
【实验原理】
由于温度升高，破坏了蛋白质的次级键，会引起蛋白质的变性。几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，变成不可逆的不溶状态。盐类和pH对蛋白质加热凝固有重要影响。少量盐类促进蛋白质的加热凝固。当蛋白质处于等电点时，不带电荷，加热凝固最完全、最迅速。在过酸或过碱溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负电荷，虽变性也不会凝固沉淀。在冷却后，调节pH达到蛋白质的等电点，则有沉淀析出。若同时有足量的中性盐存在，则蛋白质可因加热而凝固。
【器材和试剂】
1．1∶10鸡蛋白溶液。
2．0.1%乙酸溶液。
3．10%乙酸溶液。
4．饱和NaCl溶液。
5．10%NaOH溶液。
【操作步骤】
取5支试管、编号，按下表加入有关试剂(单位：滴)：

 

试剂管号

 

1∶10鸡蛋白

 

0.1%乙酸

 

10%乙酸

 

饱和NaCl

 

10%NaOH

 

蒸馏水

 

1

 

2

 

3

 

4

 

5

 

10

 

10

 

10

 

10

 

10

 

—

 

5

 

—

 

—

 

—

 

—

 

—

 

5

 

5

 

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—

 

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2

 

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—

 

—

 

—

 

—

 

2

 

7

 

2

 

2

 

—

 

5

1．将各管混匀，观察记录各管现象后，放入沸水浴中加热10min，注意观察比较各管的沉淀情况。然后，将第3、4、5号管分别用10％NaOH或10％乙酸中和，观察并解释实验结果。
2．3、4、5号管继续分别加入过量的酸或碱，观察它们发生的现象；然后，用过量的酸或碱中和第3、5号管，沸水浴加热10min。
观察沉淀变化检查这种沉淀是否溶于过量的酸或碱中，并解释实验结果。
【思考题】
1．如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果，此时可对水解程度作出什么结论?
2．能否用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在?
3．为什么鸡蛋清可用作铅、汞中毒的解毒剂?
4．蛋白质分子中的哪些基团可以：
(1)与重金属离子作用，而使蛋白质沉淀?
(2)与有机酸、无机酸作用，而使蛋白质沉淀?
(3)与生物碱试剂作用，而使蛋白质沉淀?