方案5 采用交联法和质谱法对蛋白质复合体进行拓扑学分析实验

一、交联反应条件的优化

不同方法得到的同种蛋白质复合体的质量与纯度不同，因此建议进行各种实验来摸索某一种蛋白质复合体的最优条件，但最好不要使用冷冻保存的蛋白质复合体（除非要进行特殊实验），因为这样常常会导致复合体的部分变性。较合理的安排是将所有的工作仔细计划后，安排好并在几天内完成，而在此期间可将蛋白质复合体于 4°c 保存。

1.（任选）若蛋白质复合体溶液的缓冲液中，含有不适合做交联反应的组分，可使用凝胶过滤将其转换为缓冲液 X。根据溶液的不同体积可选用 Bio-Spin 柱（50~100ul ）、Micro-SpinG-25 柱（10~100ul）或重力流驱动的 NAP 柱（0.1~2.5 ml)，具体可参照操作说明。

凝胶过滤步骤很简单：

（1）用缓冲液 X 平衡层析柱；

（2）加样；

（3）收集洗脱液。

凝胶过滤法的除盐效率一般为 95%~98%。举例来说，含有 100 mmol/L Tris 的样品溶液，在用这种方法除盐后，溶液中仍残留有 2~5 mmol/L 的 Tris。因此，要使缓冲液符合实验要求，必须重复过柱。另一种除盐的方法是透析，但耗时较长。

2.（任选）浓缩样品。参照操作说明，可用超滤装置快速（约 10 min) 而有效地使样品得到浓缩。

为保证在进行⑩ 步操作时，有足量的蛋白质能加样到胶上，对蛋白质溶液进行浓缩往往是必需的。在加样之前，对凝胶洗脱液进行蛋白质沉淀来进行浓缩的效果要比使用超滤方法差，所以这里不推荐使用。为了减少由于超滤膜对蛋白质的吸附而造成的样品损失，可以将膜用含 1mg/ml BSA 的缓冲液 X 冲洗 3 次，使膜在样品浓缩前得到封闭。

3.将 13 支微量离心管置于冰上，并在每支管中加入 26ul 的蛋白质复合体溶液。

要点：为区分交联反应的底物与产物，须做一个不加交联剂的空白对照。

4.在天平上称取 Img 左右的交联试剂，将它们溶于预冷的 DMSO 或蒸镏水中，制备成浓度为 10 mmol/L 的溶液。

EDC:1.9 mg/ml 蒸馏水

BS3:5.7 mg/ml 蒸馏水

BMH：2.8 mg/ml DMSO

SMCC:3.3 mg/ml DMSO

要点：交联试剂很容易迅速水解，因此应尽快完成操作。勿使用冷冻的试剂！

5.用 10 mmol/L 的各种交联试剂储备液，在冰水中稀释配制 lmmol/L 和 0.lmmol/L 的稀溶液。

6.将每种稀释度（0.lmmol/L，1mmol/L，10 mmol/L) 的交联剂各 3ul，加入含蛋白质复合体的小管中（见步骤③），以测定出最适宜的交联剂浓度。

7.将小管在冰上 2°C 条件下孵育 lh。

8.加入 1ul 的终止液，使反应终止。继续孵育 10 min。

9.每个样品加入 4 X SDS 上样缓冲液，在 70°C 水浴或加热器上加热 10 min。

10.用低浓度的 SDS-PAGE 胶分离蛋白质复合体的各组分（其中一些将发生交联），其中应包括未加入任何交联试剂的空白对照。

SDS-PAGE 凝胶的浓度，取决于交联产物的大小，以及是否要对凝胶进行处理，聚丙烯酰胺的比例越小，凝胶就越易破裂，较好的比例为 6%，当然若待测定的蛋白质分子量较小，则不宜采用。为了增加低浓度胶的稳定性，可加入 1/6 体积 2% 的预聚合丙烯酰胺溶液。在凝胶上，加预染色的分子标记，可使电泳一直进行，直至已知的蛋白质分子走到凝胶底部为止，便于其他迁移较慢的分子能更好地分开。

11.分析出最适宜的交联试剂及它的最佳浓度后，交联反应条件的优化还包括：

（1）设定不同的交联反应时间：从 10 min 到 2 h;

（2）设定不同的反应温度：从 2°C 到室温，每级温度相差 5°C。

二、交联产物的分离及进一步分析

12.最佳交联反应条件确立后，若需要，按步骤①和步骤②准备待用的蛋白质复合体样品。

13.将选用的交联试剂，加人蛋白质复合体样品中，在最佳反应条件下孵育混合物。

要点：记得做一个只有蛋白质复合体而不含交联试剂的对照。

14.重复步骤⑧~⑩。

若在 SDS-PAGE 后还要进行质谱分析，则在制备 SDS-PAGE 胶时必须考虑以下几点：所有溶液必须是很干净的，以避免角蛋白污染，最好使用刚刚过滤的溶液；对那些需要使用手套的步骤要特别注意，因为静电电荷效应增加了污染的可能性，最终待测的蛋白质样品，在凝胶上所占的体积要尽可能的小，这样的凝胶做质谱分析时，灵敏度最好。而减小凝胶体积的方法包括使用空隙厚度为 Imm 的胶板制胶，尽量取得较好的分离效果（如可能，使用预制胶条按步骤? 精确切割条带。

15.染色显示蛋白质（见第 2 章，方案 2~7)。通过比较 SDS-PAGE 胶上加入与未加入交联剂的样品，找出含有交联蛋白质的条带。

16.精确切下感兴趣的条带，并用质谱进行分析（见第 2 章方案 1)。

虽然待检的蛋白质发生了交联，但无须采用特殊的预备措施，只需尽可能地减少消化（第 7 章）缓冲液的用量，以保证上清中肽片段浓度足够大，这样在质谱分析前就可以不用对样品进行抽提，从而避免肽片段的损失。