采用优化红球菌的地高辛标记探针的DNA印迹方案

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警示：在我们的手册中介绍的实验可能具有潜在的危险性，要求操作人员具有相当的安全训练、特殊装备、以及相关安全部门的监督。作为实验操作员的你承担全部的责任、义务和由于实施安全步骤和措施带来的危险。麻省理工大学没有责任、义务或承担由于实施本材料中内容所引起的危险

xian o’brien 大公无私地为此测试，优化和作图
黑体字表示的试剂列在方案末，以斜体字标明Roche DIG标记和测试工具箱
采用地高辛高效标记混合物(ROCHE) 标记DNA探针
y 将10 ng~3μg的DNA探针（基因组 、质粒或基因片段）用蒸馏水稀释至16μl
y 煮沸10分钟使DNA变性，迅速放在冰上冷却，以防其重退火。
y 加入4μl地高辛高效标记混合物，振荡混匀
y 37°C下过夜培养
y 加入2μl 0.2M EDTA (pH 8) 使反应停止，并于65°C 下10min加热降低其活性。
y 使用前煮沸探针 10-20min
y 使用过的探针 可以储存在-20°C的杂交缓冲液中，并能重复使用。
将DNA从凝胶转移到膜上
y 将凝胶在合适的电压下进行电泳得到单一的带型；染色并照相以参考大小。
y 小片段转移较有效。对于大的DNA片段，可增用短波透射仪进行2分钟的紫外切割步骤
y 将凝胶转移至可密封的Tupperware 塑料容器中
传统的转移方法
y 室温下在0.25的盐酸中培养40分钟（要盖住凝胶），使之脱去嘌呤
y 将2X置于MilliQ溶液中漂清
y 将2X置于变性溶液中培养20min以附着在脱嘌呤位点
y 在中性溶液中培养30min
y 如图所示，采用20X SSC作为转化溶液，进行毛细管转化
y 转化过夜（48小时脉冲场凝胶电泳）
另供选择的快速转化方法（Phil 的最爱）
y 室温下于0.25 M HCl中培养直至染色带变成黄色（20分钟）
y 将2X置于MilliQ溶液中漂清
y 如图所示，采用0.4N 的NaOH溶液作为转化溶液，进行毛细管转化
y 转化过夜（48小时脉冲场凝胶电泳）