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    方案12 蛋白质阵列：标记复合体并通过阵列检测来研究蛋白质-小分子相互作用

    相关实验：蛋白质复合体性质的研究

    最新修订时间：

    材料与仪器

    用于标记的小牛血清白蛋 目标小分子 载有蛋白质阵列的玻片
    单功能活性染料Cy-3或Cy-5 磷酸盐缓冲溶液 含有 500mmol L甘氨酸的 PBS 二琥珀酰亚胺戊二酸（DSG) N N’-二琥珀酰亚胺碳酸盐 硫代琥珀酰亚胺酯 含 0.01g ml小牛血清白蛋白（BSA)的 PBST
    荧光玻片扫描仪 凝胶过滤装置 保湿器 孵育箱

    步骤

    一、BSA 的标记

    ① 将 I m g B S A 溶 于 0 •5m l的 P B S (PH7.5 ) 中，然后将溶液倒入装有单功能活 性 染 料 （ Cy- 3 或 Cy- 5 ) 的管中。 ② 室温条件下，孵育 B S A 和染料的混合物30min。 ③ 在溶液中加人100//1含 500mmol/L 甘 氨 酸 （ pH 8. 0 ) 的 P B S ， 以终止反应。 在室温条件下继续孵育30min。 ④ 用 凝 胶 过 滤 除 去 未 掺 入 的 染 料 ，用 P B S (p H 7. 5 ) 作 洗脱缓冲液。

    二、小分子与 BSA 的连接

    ⑤ 小分子与B S A 偶联的适宜方法决定于小分子的功能团。 由于篇幅的限制，这里不能逐一介绍每种可能出现状况的处理方法。 关于生物相关的化学方面的介绍，可 查 阅 Hermanson (1996)。下面介绍 的方法只作为一般性指导。具体实验细节依据研究对象的性质。 若需连接在小分子的C 末端，贝 IJ: a. 在基本条件下，采用 N ，] NT-二琥珀酰亚胺碳酸盐作为一种N -羟基 琥珀酰亚胺酯，以活化C 末端。 b•在PBS (pH7. 5 ) 中，将 活 化 的 复 合 体 与 B S A 相 混 合 ，室温孵 育 lh 。 小分子与B S A 的混合比例取决于复合体，但在开始的时候可以采用 10 : 1 (摩尔比），加人过量的小分子。 c. 用凝胶过滤将连接产物和复合体分离。 若需连接在小分子的N 末端，则 ： a. 用 至 少 1 0 倍物质的量的D S G 活化小分子。 b•将未反应的D S G 和复合体二聚体与活化的复合体分开。 c. 在 P B S (p H 7. 5 ) 中，将 活 化 的 复 合 体 与 B S A 混 合 ，室温孵 育 l h 。 小分子与B S A 适宜的混合比例取决于复合体，但在开始的时候可以 采 用 10 : 1 (摩尔比），加入过量的小分子。
    d•用凝胶过滤法纯化连接产物。 若需连接在小分子的巯基基团上，贝 IJ: a. 用硫代-G M B S 活化被标记B S A 。 将硫代-G M B S 溶 于 P B S (p H 7 . 5 ) 中，使 其 浓 度 为 l〇 m g /m l 。将 5〇 等份的硫代-G M B S 加 人 到 花 菁 标 记 的 浓 度 约 为 l m g /m l 、溶 于 P B S (p H 7. 5 ) 的 B S A 溶 液 中 。例 如 ，将 29jul 10m g /m l 的硫代-G M B S 加到 I m l 花菁标记的、浓度约为l m g /m l 的 B S A 中。室温 孵 育 lh。 b. 加 入 1/10体 积 的 含 有 500m m o l /L 甘 氨 酸 （ p H 8. 0 ) 的 P B S ，终 止反应，室温条件下孵育30min。 c. 用凝胶过滤法去除未掺人的试剂。 d•在溶解于P B S (P H 7. 5 ) 中的花菁标记的B S A -马来酰亚胺复合体 溶液中，加 入 100倍物质的量的硫代小分子。室温孵育 lh。 e. 用凝胶过滤法纯化最终产物。

    三、探针标记阵列

    ⑥ 用含 有 〇.Olg/ml B S A 的 P B S T 稀释双标记的B S A 复合体。 建议开始时采用的浓度为lO^g/m l ，但也可考虑采用略高或略低的反 应 浓 度 （ 在 〇..l^g/m l 和 lOOfig/m l 之间）。 ⑦ 用稀释后的双标记B S A 复合体溶液对蛋白阵列进行探针标记。 单阵列玻片操作方法 a. 将 CoverWell玻片孵育箱放在桌子上，有衬垫的一面朝上。 b. 加 入 550^1探针标记溶液。 c. 将微阵列玻片慢慢沉下，置 于 CoverWell上 方 ，带有阵列的一面 朝 下 。 d. 插入玻片并轻轻压好玻片，注意要让CoverWell牢牢地封住玻片。 若操作正确得当，溶液会漫过玻片表面，且不会产生气泡。 多阵列玻片操作方法 a. 对每个阵列来说，在玻片正确的一面上，加 上 10〜30W 标记蛋 白。不要用盖玻片或CoverWell覆盖阵列。 b. 将玻片放入一保湿器中。 ⑧ 在室温条件下孵育玻片lh。 ⑨ 用 P B S T 将玻片洗净后，再 用 P B S T 把玻片冲洗3 遍 ，每 次 2〜3min。 ⑩ 用 P B S (没有T w e e n-20的）将玻片洗净后，用一配有可放置玻片转子的离心 机 在 200g 条件下离心30s，以去除残留的缓冲液。 ' ⑪ 用 荧 光 玻 片 扫 描 仪 来 检 测 玻 片 的 成 像 （ 参 见 “10.8.4阅读和解析蛋白质阵 列”)。 若没有合适的转子配置，也可以采用通氮气流的方法来干燥玻片。

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    来源：丁香实验

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