电泳分离的蛋白质肽谱和序列分析实验

1.加入 100ul 过氧化氢到 900ul 甲酸中，在室温下放置让，将反应产生过甲酸 (HCOOOH)。 2.在冰上冷冻过甲酸至 0°C。 3.在预冷的小试管中，将蛋白质溶解于 50ul 过甲酸中（500ug/ml)。 4.盖上帽子，0°C 孵育混合物 4 h。如果蛋白质不溶，把反应延长到 20 h。 5.加入 30ul 氢溴酸，去除多余的过甲酸。

一、样品还原 1.在还原缓冲液中，溶解蛋白质样品（约 10 mg 蛋白/ml)。 2.加入准确称量的物质的量大约是蛋白质 60 倍的固体 DTT(比如，大约是蛋白质重量的一半），或使其终浓度为 0.lmol/L。 3.在溶液上方轻轻吹氮气（或氩气）30s。 可以在氮气罐调节阀的聚乙烯塑料管口接一根巴斯德吸管，调节氮气流以至于手背基本觉察不到。 4.

一、样品还原 1.利用冷冻干燥离心机蒸发纯化的蛋白质样品溶液（含 0.01%~0.02% Tween-20)，直到少于 10ul。 2.加入 150ul 储存液到含有近乎干燥的蛋白质样品的离心管中，轻轻弹击或振荡离心管，使样品彻底混匀，然后略微离心样品。 3.加人 16ul 还原缓冲液，使 DTT 的终浓度为 15 mmol/L。 4.样品在 40°C 孵

方法 1: 自由巯基 1.加人 3 ml 反应缓冲液到样品管和对照小试管中。 2.在 412nm 测定吸收值（吸收值应该调节至0，Abuffer)。 3.加人 100ul 反应缓冲液到对照小试管中。 4.加人 100ul Ellman 试剂到样品小试管中，在 412nm 测定吸收值（Adtnb)。 5.加入 1000 蛋白质溶液到对照小试管中。

1.冻干的蛋白质底物溶解在 1% 的碳酸氢铵中，控制使用尽量少的溶液体积，以达到较高的底物浓度。 当蛋白质底物很微量（如小于 1mg) 时，加入 Tween-20 到碳酸氢铵中使其终浓度为 lg/L，否则底物（和酶）会吸附在管壁上，造成样品损失。碳酸氢铵是一种易挥发的缓冲溶液，通过冷冻干燥轻松去除。PH8 的不易挥发的缓冲溶液，例如 0.05 mol/L Tris-HCl （pH

一、还原 1.将蛋白质溶解在 0.2mol/L 碳酸氢铵中，终浓度为 10~20mg/mL。 2.加人β-巯基乙醇，其浓度在 1%~5% 之间（体积分数）。 3.在溶液上方吹扫氮气以置换氧气，盖上试管，在室温下孵育付夜 4.用 SpeedVac 浓缩器干燥样品。加热样品会有助于碳酸氢铵挥发。 二、溴化氰切割 5.将干燥的样品（10~20 m

1.将蛋白质直接溶解于切割缓冲溶液中，终浓度为 5 mg/ml。 2.混合物在 45°C 孵育 4 h。 3.冷却样品以终止反应，加人浓缩后的蚁酸 [或 3 倍体积的 2%(体积分数）TFA 水溶液]，调整 pH 为 2.5。 4.通过层析使样品在柱子上脱盐。通过液相层析立刻分析肽段混合物，或者储存样品在-20°C 以备以后分析。 5.如果利用凝胶电泳进行

1.将邻亚碘酰苯甲酸 10 mg 溶解于 1.Oml 的 80% (体积分数）乙酸，瘠液中含有 4mol/L 盐酸胍和 20ul 对甲酚。 2.混合物在室温下孵育 2 h。 3.加入蛋白质，使终浓度为 5~10 mg/ml。以氮气流中冲洗试管，室温于黑暗中孵育 24 h。 4.加入约 10 倍体积的水终止反应，用 SpeedVac 浓缩器（或其他类似设备）干燥。或

一、染胶 除非特别提到，否则应在室温下进行染色。 1.把含有目标蛋白质的凝胶放到装有考马斯亮蓝染色液的塑料皿中，使染色液覆盖凝胶。把塑料皿放到机械摇床上，在室温下染色 20 min。 2.去除染色液，加入脱色液和三张高级纸巾。振摇脱色。更换几次脱色液，直到凝胶完全脱色。 纸巾用于吸收释放出来的染料。 二、考马斯亮蓝染色凝胶的保存 3.如枣凝

方法 1: 直接用咪唑、SDS 和锌负染色 1.将胶浸放在固定液中 20 min，并轻轻摇动。 2.弃掉固定液，用去离子水洗胶 2 次，轻轻摇动 15 min。 3.将胶与含有0.1%SDS 的 0.2mol/L 咪唑共孵育 15 min，并轻轻摇动。 4.去掉咪唑-SDS 液，胶中加入0.2mol/L 硫酸锌，搅动 30~60s。 5.当胶的染色

1.将凝胶放在塑料皿中（用一次性的塑料皿或者彻底洗过的塑料皿），加入足量的固定液以覆盖凝胶。固定 20 min, 并轻轻摇动。 2.弃掉固定液，加人足量的 50% 甲醇覆盖胶，轻轻摇动 10 mm。 3.弃掉甲醇，加人去离子水，再摇动 10 min。 4.弃掉去离子水，在 0.02% 的硫代硫酸钠中浸泡凝胶 1min。 5.用去离子水洗凝胶 2 次，每次

方法 1: 整块凝胶的还原和 S-吡啶乙基化 1.保证整块凝胶的正确染色和脱色（见方案 9)。 2.在 400~500 ml 水中清洗凝胶 3 次，约 1.5 h。 这一步骤是为了除去脱色液中的乙酸，否则乙酸会反方向地影响还原缓冲溶液的 pH 值。 3.将凝胶转移到一个干净的器皿中。 4.将凝胶浸在 50 ml 的还原缓冲溶液中（体积取决于凝胶和器

1.切下凝胶上的蛋白质点，放人小离心管中。 2.以 0.lmol/L NH4HCO3、50% 乙腈（用于胰酶）或 0.05mol/L Tris-HCl(PH9.3)、50% 乙腈（用于 Lys-Q 各 1 ml，清洗凝胶 2 次，以去除多余的考马斯亮蓝染液。 3.离心冷冻干燥，使每一片凝胶完全干燥。当完全干燥时，每一片凝胶应不会粘到离心管壁上。 4.加入 10ul

一、电印迹和染蛋白 1.将蛋白质电印迹到硝酸纤维膜或 PVDF 膜上。 一般 0.5 mm 厚的凝胶，转膜需要 2 h。对于很难转移的蛋白质，可在转移缓冲液中加入 0.005% 的 SDS。硝酸纤维膜要比 PVDF 膜易于转移，因为 PVDF 膜有不易被水沾湿的表面，限制了肽段的回收。因而，硝酸纤维膜具有较高的肽段回收效率。 注意：在氨基末端序列测定之后，

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方法 1: 酶催化的蛋白质片段化 1.固定聚丙烯酰胺凝胶中分离的蛋白质，用考马斯亮蓝染色（5~lOmin)，然后脱色。 如果蛋白质条带太浅，重复染色和脱色的步骤，或延长染色时间。 2.将凝胶放入透明的盒子中，用手术刀切下蛋白质条带，把条带分别放入聚丙烯试管中。 3.用 10 ml 含有 1 mol/L Tris-Cl 的乙醇，浸泡切下来的含有对照蛋白点的凝