方案12 胶内蛋白质的S-吡啶乙基化实验

方法 1: 整块凝胶的还原和 S-吡啶乙基化

1.保证整块凝胶的正确染色和脱色（见方案 9)。

2.在 400~500 ml 水中清洗凝胶 3 次，约 1.5 h。

这一步骤是为了除去脱色液中的乙酸，否则乙酸会反方向地影响还原缓冲溶液的 pH 值。

3.将凝胶转移到一个干净的器皿中。

4.将凝胶浸在 50 ml 的还原缓冲溶液中（体积取决于凝胶和器皿的大小）。在 4℃ 孵育凝胶 2 h。

5.加入 4-乙烯基吡啶到还原缓冲溶液中，终浓度为 2%(体积分数）。避光室温孵育 lh。

6.加人过量的 2-巯基乙醇（终浓度 2%，体积分数），以终止烷基化作用。

7.在 400~500 ml 水中清洗凝胶 3 次，约 1.5 h。

这一步骤是为了除去/5-巯基乙醇，否则会干扰蛋白质水解。

8.如果蛋白质条带不再可见，重复染色和脱色步骤（见方案 9)。

方法 2: 蛋白质条带的还原和 S-吡啶乙基化

1.保证整块凝胶的正确染色和脱色（见方案 9)。

2.切下目标斑点或条带，放在干净的 1.5 ml 聚丙烯小离心管中。

3.每次用 Iml 水彻底清洗切下来的凝胶，共 3 次，约 45 min。或者用冷冻干燥离心机完全使凝胶脱水。

4.从小离心管中弃掉去离子水。

5.加入足量的还原缓冲溶液，完全覆盖胶（通常 100~200ul)。

脱水的凝胶吸收还原缓冲液后会膨胀。应确保有足够的还原缓冲液覆盖凝胶。

6.在 40°C 孵育凝胶 lh。

7.加人 4-乙烯基吡啶到还原缓冲溶液中，终浓度为 2%(体积分数）。室温下避光孵育 lh。

8.加人过量的/5-巯基乙醇（终浓度 2%，体积分数），以终止烷基化作用。

9.用微量移液器或巴氏滴管吸去还原缓冲液，弃掉。

10.每次在 1ml 水中彻底清洗凝胶，共 3 次，约 45 min。