方案2 蛋白质还原和S-羧甲基化：大规模方法

蛋白质链间或链内完整的二硫键，会给酶解或化学裂解带来麻烦。如：

1.二硫键连接的肽段洗脱物，在基于RP-HPLC的肽段作图中会产生单个的峰，从而使这些肽段图很难解释；

2.最理想的方法是在序列测定之前，分离由S—S键连接的肽段，否则会使序列数据的解释变得复杂；

3.没有断裂二硫键的蛋白质不便于蛋白质的片段化。

用于断裂二硫键的最普通方法，是将胱氨酸还原成半胱氨酸残基。可是，半胱氨酸残基具有很高的反应性，导致序列测定变得复杂（比如，形成随机二硫键，以及在去掉还原剂后很容易被氧化）。基于这个原因，通常要使它们变成稳定的衍生物（如通过烷化作用）。

在本方案中，完整的蛋白质（>lmg) 首先被还原，然后被碘乙酸（或碘乙酰胺）S-羧甲基化，得到半胱氨酸衍生物 S-羧甲基胱氨酸（或 S-羧甲基半胱氨酸），利用化学测序方法很容易检测。另一种常用的烷基化试剂是 4-乙烯基吡啶，产生 4-乙烯基吡啶半胱氨酸（RafteryandCole,1996)。4-乙烯基吡啶半胱氨酸很容易通过 Edman 降解法（作为 PTH 衍生物）和基于质谱的序列测定方法加以检测。对于微量蛋白质（<100ug）的还原和 S-羧甲基化，见方案 3。

一、样品还原

1.在还原缓冲液中，溶解蛋白质样品（约 10 mg 蛋白/ml)。

2.加入准确称量的物质的量大约是蛋白质 60 倍的固体 DTT(比如，大约是蛋白质重量的一半），或使其终浓度为 0.lmol/L。

3.在溶液上方轻轻吹氮气（或氩气）30s。

可以在氮气罐调节阀的聚乙烯塑料管口接一根巴斯德吸管，调节氮气流以至于手背基本觉察不到。

4.37°C 孵育蛋白质溶液 3 h。

5.如果需要，-SH 基团的数量可以用 Ellman 法测定（见方案 4)。

二、样品烷基化

有些情况下，经还原和烷基化的蛋白质可以通过 RP-HPLC 迅速脱盐，然后在少量易挥发溶剂中复性。这种方法对于低分子质量（10~25kDa) 的蛋白质，比如生长因子和细胞因子尤为有效。利用 RP-HPLC(TFA/乙腈溶剂系统）脱盐（和样品浓缩），已经成功地应用于微量样品（见方案 3)。

6.在冰上冷却、还原蛋白底物溶液。

7.加人新鲜配制的溶解于少量（约 0.2 ml) 烷基化缓冲液中的碘乙酸（最多与蛋白质底物等质量或者用少量的碘乙酸钠贮备液（每 100ul O.lmol/L NaOH 中溶入 15 mg 碘乙酸），使其物质的量略大于混合物中-SH 基团的数量（即蛋白质的-SH 基团加上 DTT)。

8.轻轻拍打管壁，混匀管中的内容物。

9.用氮气注满反应管，持续 30s。

10.室温避光，孵育反应 15 min。

避光反应是为了防止碘乙酸分解产生碘离子。

11.加入稍过量的卜巯基乙醇（每 5 mg DTT 约 50ul），以去除多余的烷基化试剂，终止反应。

12.用浓盐酸调节溶液的 pH 为 2~3 滴 0.5ul 的反应混合物到 pH 试纸上，以检查溶液的 pH。

我们推荐用小规模的实验来检验烷基化蛋白质的可溶性（由于蛋白质不同其溶解性会有显著差别）。可选用的易挥发的溶液和缓冲盐包括 1mol/L 乙酸（pH2.1)，10 g/L NH4 HCO3(pH7.8) 和 0.2mol/L N-乙基吗啉乙酸缓冲液（pH8.0)。蛋白质可以通过冻干从这些溶液中提取。

三、S-羧甲基蛋白质的回收（脱盐）

经还原和烷基化的蛋白质，可以在挥发性溶液（比如 1mol/L 乙酸）中析出，或从缓冲盐溶液（比如碳酸氢铵）中脱盐。可是这一方法费时（一般 24 h 中需要换几次透析液），而且蛋白质损失较大。透析后的蛋白质可以通过冻干回收。

13.去掉多余的试剂，通过尺寸排阻层析，使蛋白质快速脱盐。

14.用冻干的方法，使还原和烷基化的蛋白质从 1mol/L 乙酸中回收，制成干粉。