方案3 蛋白质还原和S-羧甲基化：微量方法

一、样品还原

1.利用冷冻干燥离心机蒸发纯化的蛋白质样品溶液（含 0.01%~0.02% Tween-20)，直到少于 10ul。

2.加入 150ul 储存液到含有近乎干燥的蛋白质样品的离心管中，轻轻弹击或振荡离心管，使样品彻底混匀，然后略微离心样品。

3.加人 16ul 还原缓冲液，使 DTT 的终浓度为 15 mmol/L。

4.样品在 40°C 孵育 4.5~5 h。

二、样品烷基化

5.还原过的蛋白质样品溶液置于室温。

6.加入 20ul 0.5mol/L 碘乙酸，至碘乙酸的终浓度为0.05mol/L。

7.25°C 避光反应 30 min。

三、S-羧甲基化蛋白质的回收（脱盐和浓缩）

8.将 2%~3%(约 300ng 蛋白质）的总混合物上样到反相微孔层析柱中（50 mm X 1mm 内径 HPLC 系统）。

在加人大量的蛋白质至 RP-HPLC 之前，用 2%~3% 的总样品（约 300ng) 做预实验，以确定样品能够从反相柱上回收。这个脱盐的预实验极为重要，因为一些蛋白质在 S-羧甲基化后会有不同的层析结果（比如，它们比天然的蛋白质更加疏水）。如果 S-羧甲基化蛋白的疏水性比天然蛋白质的疏水性高得多，用 TFA/乙腈溶剂系统就很难从反相柱上回收蛋白质。这时可试用正丙醇代替乙腈，如果仍不行，试着用微尺寸排阻层析或快速微型脱盐系统对 S-羧甲基化蛋白进行脱盐。

9.一旦确定 S-竣甲基化蛋白质能够从反相柱上回收，即可加人剩余的蛋白质样品。

10.至于 Tween-20 调节含有 S-竣甲基化蛋白的部分（一般在 300~500ul 0.1% TFA 水溶液/乙腈中），至终浓度为0.2 g/L。关于收集到的 S-羧甲基化蛋白的酶解消化，见方案 5。