方案4 用Ellman 试剂测定自由巯基和二硫键实验

方法 1: 自由巯基

1.加人 3 ml 反应缓冲液到样品管和对照小试管中。

2.在 412nm 测定吸收值（吸收值应该调节至0，A_buffer)。

3.加人 100ul 反应缓冲液到对照小试管中。

4.加人 100ul Ellman 试剂到样品小试管中，在 412nm 测定吸收值（Adtnb)。

5.加入 1000 蛋白质溶液到对照小试管中。

6.加人 100ul 蛋白质溶液到样品小试管中，混匀，3~5 min 后测定吸收值，直到其值不再增加。记为 A_final。

7.根据以下公式计算巯基的浓度：

方法 2: 二硫巯基

本方法除了蛋白质样品首先要烷基化（无需预先还原），以得到自由的巯基（但保持二硫键完整）以外，基本与方法 1 相同。可以通过碘乙酸或 4-乙烯基吡啶进行烧基化（见方案 2)。

1.把样品溶解在反应缓冲液或者变性缓冲液中（在 100ul 中至少含有 2nmol)。

2.加人新鲜制备的 DTT(终浓度为 10~100 mmol/L)，用氮气流代替氧气，25°C 反应 1~2 h。

3.通过透析或尺寸排阻层析，对还原后的样品进行脱盐。

4.测定蛋白质浓度（基本实验流程，见附录 2)，用方法 1 中描述的步骤分析新暴露出来的巯基。