大规模蛋白质相互作用研究方法进展

关 薇, 王 建, 贺福初~1~0~0~0~0~Kbr_~H~M~1~0~0~0~0（军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850）
摘　要：随着2000 年酵母大规模蛋白质相互作用网络图谱的成功描绘，蛋白质相互作用特别是大规模蛋白质相互作用研究成为生命科学领域的又一个研究热点。酵母、果蝇、线虫以及人类蛋白的大规模相互作用图谱的相继完成，不仅对系统研究细胞内各种生命活动有着重要意义，也标志着蛋白质相互作用研究方法的不断发展和完善。本文综述了当前大规模研究蛋白质相互作用的技术方法并进行了比较分析。每种技术都有其各自的优缺点，在实验中要根据不同的要求和目的选择适宜的方法。
关键词：蛋白质相互作用；酵母双杂交；串联亲和纯化

The advance in research methods for large-scale protein-protein interactions
GUAN Wei, WANG Jian, HE Fu-Chundefined
(Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China)
Abstract: In 2000, the first network of large-scale protein-protein interactions was accomplished in yeast. It was a historic moment and became another hot spot of protein research. Subsequently, such proteins interaction maps were also brought to success in the fly, worm and even human during five years. So rapid progress in large-scale protein-protein interactions turned up many new angles of view for investigating the mechanisms of cell functions, actually it also suggested the development and complement of research method itself. In this article we summarized the progress of techniques in large-scale protein-protein interactions and showed their differences. Anyway, the researchers should choose right means to perform their diverse intentions.
Key words: protein-protein interaction; yeast two hybrid; tandem affinity purification

人类基因组测序的完成标志着一个新的生物学研究时代——后基因组时代(post-genomic era)的来临。科学家们的研究热点又回到蛋白质上，全基因组的序列信息并不足以解释及推测细胞的各种生命现象，蛋白质才是细胞活性及功能的最终执行者。构成细胞的所有组成蛋白有多少；他们的动态相互作用关系又如何；细胞内所有蛋白即蛋白质组又是怎样组织在一起形成有功能、有秩序的网络结构？
这些问题的解决才是最终阐明细胞中各种生命活动机制的关键所在[1]。
1　大规模蛋白质相互作用研究的目的及意义
生物体内各种生命信息由不同的基因经转录、翻译传递到相应的蛋白质上并使其具有各自的生化特性及生物学活性；但每个蛋白质并不是独立的在细胞中完成被赋予的功能，它们在细胞中通常与其他蛋白质相互作用形成大的复合体，在特定的时间和空间内完成特定的功能，而且有些蛋白质的功能只有在复合体形成后才能发挥出来，如依赖于构象变化或翻译后修饰的蛋白质功能[2] ；另一方面，某些蛋白质可能参与了不止一个的复合体，简单的两两相互作用研究就不足以阐明这种更为复杂的相互作用，因此，大规模、高通量的蛋白质相互作用研究应运而生，其目的是在细胞的特定生理条件下，从一个蛋白到多个蛋白，从一个复合体到多个复合体，进而描绘出整个蛋白质组中蛋白间相互作用的网络图。基于这些作用关系，科学家们才能从真正意义上阐明一个蛋白质的功能，才有可能研究细胞中某一生理活动中所有相关蛋白质的变化及作用机制。大规模蛋白质相互作用的研究还有助于了解细胞中不同生命活动之间的相互关系。
2　大规模蛋白质相互作用的研究策略及方法
研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。若研究者想得到细胞中能与某一蛋白结合的所有未知蛋白质，则实验的关键是得到细胞中含有靶蛋白的复合体，经过有效地分离纯化后，逐一鉴定复合物中的各个组分；或者采用一对多的筛选方法，如酵母双杂交，在建立的蛋白表达文库中检测可能与靶蛋白相互作用的蛋白质。值得注意的是在这一策略中实验结果的进一步验证是必不可少的。目前用于大规模研究蛋白质间相互作用的方法包括酵母双杂交、串联亲和纯化、质谱鉴定、蛋白芯片以及基于生物信息学的分析方法等。
2.1　酵母双杂交　该系统由Fields 和Song[3]首先在研究真核基因转录调控时建立。利用真核生长转录因子的两个不同的结构域：DNA结合结构域(DNAbinding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)，分别与目标蛋白X 及可能与目标蛋白相互作用的蛋白Y 相连，并共同转入酵母细胞。如果蛋白X与Y能够发生相互作用就能使转录因子原来分开的两部分结合，形成完整的活性形式从而激活下游报告基因。通过检测报告基因的表达产物就可判断两种蛋白是否发生相互作用[4~5]。
这一经典的蛋白相互作用研究方法接近于体内环境，那些瞬时、不稳定的两两相互作用也可以被检测到，并且与内源蛋白的表达无关[6]。鉴于这些优点并结合简便高效的Gateway表达载体构建方法[7]，在大规模的蛋白质－蛋白质相互作用研究中酵母双杂交系统得到了最为广泛的应用。Rain 等[8]用该法绘制了人类胃肠道病原菌Helicobacter pylori 的大规模蛋白质相互作用图谱。在261 种蛋白中，确立了 1200 种相互作用关系，涵盖了整个蛋白质组得46. 6%。随后，Giot 等[9]和Li 等[10]在果蝇和线虫中也成功地研究了大规模的蛋白质相互作用。除了对模式生物的研究外，Stelzl 等[11]和Raul 等[12]则先后分析了人脑组织、人已知ORF中大规模的蛋白质相互作用网络。但酵母双杂交方法本身也有一定的局限性：(1)不能研究具有自激活特性的蛋白质；(2)只能检测两个蛋白间的相互作用；(3)检测的相互作用需发生在细胞核内，对于不能定位到细胞核中的蛋白质无法研究；(4)大部分实验中有将近50%的假阳性率，且推测的相互作用仅有3% 在两种以上的实验中得到验证。为了弥补方法本身的缺点及局限性，研究者也不断地对其进行完善和改进。Stelzl 等[11]在研究中就采用了以下的策略：(1)选择不同功能、不同大小的蛋白作为诱饵，以确保所选靶蛋白在整个蛋白质组中的代表性；(2)筛选过程中采用两轮杂交的方法：第一轮以混合诱饵(8 个)对文库进行筛选，结果呈阳性的克隆再进行一对一的第二轮杂交，这样既降低了工作量又提高了结果的准确性；(3)pull-down，免疫共沉淀对酵母双杂交的结果进行体内的相互作用验证；(4)利用生物信息学的方法对结果进行系统分析，包括基因的染色体定位、蛋白质作用网络的拓扑结构分析等，从多方面分析结果的可信度。据此，他们最终确认了911 对高可信度的相互作用涉及到401 种蛋白，数据分析中设立了6 个标准来判定得到的结果，大大提高了酵母双杂交实验结果的可信度。生物秀-专心做生物 www.bbioo.com