材料与仪器
胶内胰酶消化缓冲液 三氟乙酸(TFA)
冷冻干燥离心机 小离心管 水浴锅
步骤
1.切下凝胶上的蛋白质点,放人小离心管中。
2.以 0.lmol/L NH4HCO3、50% 乙腈(用于胰酶)或 0.05mol/L Tris-HCl(PH9.3)、50% 乙腈(用于 Lys-Q 各 1 ml,清洗凝胶 2 次,以去除多余的考马斯亮蓝染液。
3.离心冷冻干燥,使每一片凝胶完全干燥。当完全干燥时,每一片凝胶应不会粘到离心管壁上。
4.加入 10ul 的含有 0.5ug 适当蛋白酶的消化缓冲液,直接倾到干燥的凝胶片上,使其重新湿润。
5.静候 10~20 min,直到溶液完全被凝胶吸收。
6.如果需要,重复步骤④和步骤⑤,使凝胶充分膨胀。
7.加入 200 沁消化缓冲液,彻底覆盖凝胶片。
8.35°C 孵育 16 h。
9.小心倾出消化缓冲液(现在应称其为抽提液),注人一个干净的小离心管中。
消化缓冲液中含有超过 80% 的可提取肽段。
10.凝胶片中加入 200ul 0.1% TFA、60% 乙腈。
11.把含有凝胶片的小离心管室温孵育 30 min。
12.仔细吸取抽提液,与步骤⑨得到的抽提液混合起来。
13.通过冷冻干燥作用,减少抽提液的体积。不要彻底干燥提体液,否则会造成样品损失。
这一步的目的是去掉抽提液中的乙腈,以减小后面稀释并注射到毛细管 RP-HPLC 系统中的样品体积
来源:丁香实验