方案14 电印迹膜上的蛋白质消化实验

一、电印迹和染蛋白

1.将蛋白质电印迹到硝酸纤维膜或 PVDF 膜上。

一般 0.5 mm 厚的凝胶，转膜需要 2 h。对于很难转移的蛋白质，可在转移缓冲液中加入 0.005% 的 SDS。硝酸纤维膜要比 PVDF 膜易于转移，因为 PVDF 膜有不易被水沾湿的表面，限制了肽段的回收。因而，硝酸纤维膜具有较高的肽段回收效率。

注意：在氨基末端序列测定之后，不可能再进行 PVDF 膜上的消化。

因为硝酸纤维素对于 Edman 化学试剂和溶剂是非惰性的，所以这种膜不能直接用于氨基末端序列分析。胺黑和丽春红 S 染色不影响蛋白质消化、从膜上提取肽段和随后的 RP-HPLC 肽段分析。

2.用胺黑或丽春红 S 染膜。

用胺黑染：

（1）把硝酸纤维膜或 PVDF 膜浸在 0.1% 胺黑 10B 染色液中，保持 1~3 mm。

（2）用水/乙酸/甲醇混合液快速冲洗几次膜，使之脱色。

（3）用去离子水彻底冲洗脱色后的印迹膜，去除过量的乙酸。

（4）剪下染色的蛋白条带（对于二维电泳，剪下蛋白点，一块胶上需要 40 个点），并把这些条带转移到 1.5 ml 的小离心管中，立即进行下面的操作步骤③，或储存在—20℃。

用丽春红 S 染：

（1）将硝酸纤维膜浸在 0.1% 的丽春红 S 中，染色 lmin。

（2）在 1% 的乙酸水溶液中轻轻搅动膜 1~3 min，去掉多余的染色液。

（3）剪下目标蛋白质条带，把它们转移到小离心管中。

（4）用 200 mmol/L 的 NaOH 洗 1~2 min，进行蛋白质条带脱色。

（5）用去离子水洗蛋白质条带, 立即进行下面的操作步骤③，或保湿储存在-20 °C(避免过分干燥）。

二、结合在膜上的蛋白质消化

1.将 I.2 ml 溶解于 100 mmol/L 乙酸中的 5 g/LPVP-40 加入到离心管中。

2.37°C 孵育 30 min。

3.1000g 离心 5 min。

4.弃掉上清液。

5.离心管中加入约 1ml 水。

在 RP-HPLC 肽谱作图之前，有必要去掉多余的 PVP-40，因为 PVP-4 〇吸收紫外线的能力非常强；而且 PVP-40 分解后的产物，会在电喷雾离子化质谱（ESI-MS) 中产生污染峰。

6.旋转离心管 5s。

7.重复步骤3和步骤4。

8.重复步骤5~6一次。

9.把硝酸纤维膜剪成小块（约 1mmX1mm), 将它们放到新的离心管（0.5 ml 或 0.2 ml) 中。

10.加入极少量的消化液（10~20ul），覆盖小块的膜。

11.37°C 放置 16 h 或过夜进行消化后，把整个反应混合物加样到 Rp—HPLC 柱，分离肽段组分（或-20℃ 储存肽段混合物直到使用）。