限制性内切酶对DNA消化的一般方案

1. 限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。

2. 20μl体积反应体系如下：

DNA                      0.2-1  μg

10×酶切buffer            2.0  μl

限制性内切酶              1-2  u（单位）

加ddH₂O                   至  20 μl

限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化1hr。

3. 用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。

4. 多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。

5. 酶切结束时，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。

6. 如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M乙酸铵（或1/10体积3M NaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g× 5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（pH 7.6）。

7. 如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。