细胞和亚细胞提取物的制备实验

要点：所有操作均在 0~4°C 进行。 1.从动物中取出组织后，修剪并去除脂类和结缔组织，然后放入预冷的匀浆缓冲液 A 中。 2.用切刀把洗好的组织切成小块（如 1cm 方块），或者把这些组织放在绞肉机上搅两次。 像肝脏、大脑、肾和心脏等组织很容易在韦林搅切器中破碎，但是骨骼肌和肺则很难，所以应在勻浆之前先用家用绞肉机来绞碎。许多纤维组织，比如哺乳动物

一、方法 A: 单层培养的细胞的裂解 1.去掉培养基，并用冷 PBS 洗细胞 2 次。 2.把培养瓶置于冰上。 3.100mm 的培养瓶（预冷至 4°C) 中加入 10ml 裂解缓冲液，裂解缓冲液的体积应根据培养瓶的大小来调整。 4.冰上孵育细胞 10~30 min(取决于所孵育的细胞系），并不时地摇动瓶子。 5.在冰上倾斜瓶子，使缓冲液流向一 边

1.将1X107~5X107个细胞加到1ml含有100 mmol/L DDT的Laemmli样品缓冲液中。 2.由于DNA的释放，在Laemmli缓冲液中细胞裂解液变得很黏，克服黏性问题有2种方法： (1)离心裂解液lOOOOOg，20 min，除去DNA; (2)超声破碎裂解细胞，每次超声15?30s，共4次，每次之间将样品在冰上放置15s。 3.在95

注意：因为要产生高压，应在保护遮蔽物后进行操作。 1.确保出口关闭（但不要过紧），并把装置放入冰中预冷（如果有必要）。 2.准备要破碎的细胞或组织。 贴壁培养的细胞：用磷酸盐缓冲液（PBS)温和地洗细胞2?3次，用橡胶细胞刮刀，把细胞从培养器皿中刮到PBS溶液中。 非贴壁培养的细胞：400g离心10min，收集细胞，用PBS洗细胞2~3次。

1.室温离心 1min，从 1ml 培养物中收集细菌。 2.去除上清，用 1ml 预冷的 0.5%(体积分数）TritonX-100 重悬细菌细胞的沉淀物。 3.超声波处理悬浮液，3 个循环，每次 20s。超声间隙把细胞放在冰上冷却。 4.将悬浮液在小型离心机中离心 lmin。 5.在上清液中加入 Lammli 样品缓冲液（含有 100 mmol/L DT

1.4°C、3000 g 离心 15 min 收集细菌。 2.用裂解缓冲液洗细胞，除去残留的培养基。重复步骤1，离心收集洗过的细胞。 3.倒出上清，称沉淀的湿重。 4.每克细胞沉淀用约 3 ml 裂解缓冲液重悬，4°C 条件下搅动悬浮液 30 min。如果沉淀物在 30 min 后没有完全悬浮，用韦林搅切器低速混合悬浮液 1min。 5.加溶菌酶至终浓度

1.如实验方案6所述裂解细胞。 2.4°C 条件下23000 g离心细胞裂解液30 min。 3.倒出上清，测定沉淀的湿重。 4.用约 10倍体积的洗涤缓冲液重悬沉淀，室温搅动悬浮液lh。 5.4°C条件下23000 g 离心混合物30 min。 6.除去上清，并重悬沉淀。 7.重复4~5步骤3次以上（直到重组蛋白的纯度>80%，用分

1.在微型离心机上离心 3 mm，以收集细胞。 2.去上清，用 PBS 重悬细胞，再离心 3 min。 3.去上清，估算细胞沉淀的体积，向细胞沉淀中加人 3 倍体积的冰浴裂解缓冲液，悬浮后置于冰上。 4.加入等体积的预冷玻璃珠。 5.剧烈振荡悬浮液 30s。 6.重复步骤5，并在相差显微镜下观察，直到大部分酵母细胞被裂解。 7.4°C 条件下在小型离心机中离心悬浮液 5 min， 8

一、细胞制备 1.在冰上预冷细胞培养物，然后用冰浴的盐溶液、PBS 或其他的非变性缓冲液洗 2~3 次。 保存 1 份洗涤缓冲液（贮存在-70°C) 以备将来进行样品校正，或用于酶、蛋白或 RNA 分析的对照材料。 2.选择下面合适的方法来处理悬浮液或单层培养物。 处理悬浮培养物：悬浮培养的细胞所需的 DDF 体积取决于细胞的湿重或细胞数量。 （1