原理
由于酵母的经典遗传分析和分子遗传分析都已经研究得非常透彻,因而对于纯化重组动物蛋白来说,酵母是一个很有吸引力的表达体系。关于培养和收集酵母细胞的讨论,尤其是芽殖酵母,参见 Jazwinski(1990)。酵母细胞的裂解方法有很多种,包括自溶、压力破碎(如 French 加压罐)、研磨(玻璃珠振荡)和酶裂解(如 Zymolase) 等。本方案讨论的振荡玻璃珠研磨,是最简便的方法之一。这对于小体积(如 <1ml, 使用微量离心管)和数升的体积(使用特制的DynoMill仪器)都是很有效的。经相差显微镜检测,细胞破碎率一般>95%。
材料与仪器
新鲜培养的酵母细胞
裂解缓冲液 磷酸盐缓冲液
预冷的玻璃珠
裂解缓冲液 磷酸盐缓冲液
预冷的玻璃珠
步骤
1.在微型离心机上离心 3 mm,以收集细胞。
2.去上清,用 PBS 重悬细胞,再离心 3 min。
3.去上清,估算细胞沉淀的体积,向细胞沉淀中加人 3 倍体积的冰浴裂解缓冲液,悬浮后置于冰上。
4.加入等体积的预冷玻璃珠。
5.剧烈振荡悬浮液 30s。
6.重复步骤5,并在相差显微镜下观察,直到大部分酵母细胞被裂解。
7.4°C 条件下在小型离心机中离心悬浮液 5 min,
8.小心地倒出上清,并转移到另一管中,置于冰上备用。
2.去上清,用 PBS 重悬细胞,再离心 3 min。
3.去上清,估算细胞沉淀的体积,向细胞沉淀中加人 3 倍体积的冰浴裂解缓冲液,悬浮后置于冰上。
4.加入等体积的预冷玻璃珠。
5.剧烈振荡悬浮液 30s。
6.重复步骤5,并在相差显微镜下观察,直到大部分酵母细胞被裂解。
7.4°C 条件下在小型离心机中离心悬浮液 5 min,
8.小心地倒出上清,并转移到另一管中,置于冰上备用。
来源:丁香实验