Northern blotting实验方案

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本文主要介绍了Northern印迹杂交(Northern blotting)实验的原理、器材和具体方法步骤。Northern blotting是一种将RNA从琼脂 糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。
 

Northern blotting

1.原理

Northern印迹杂交(Northern blotting)将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为western blot 。Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。

2仪器

恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器 ，电炉(或微波炉)，离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。

3材料

总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜

4试剂

NorthernMax Kit(Cat. # 1940，Ambion, Inc.)，琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111TBq/mmol，[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。

5. 方法与步骤

5.1 用具的准备：

180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。

电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。

处理DEPC水(2 L)备用。

5.2 用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染。

用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。

5.3制胶：

5.3.1 称取0.36 mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4 ml DEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)

5.3.2 在通风厨中加入3.6 ml的10×Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。

5.3.3 将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5 cm。

5.3.4 胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加1×MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。(配制250 ml　1×MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。)

5.3.5 检查点样孔。

5.4. RNA样品的制备

在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB(终浓度为10ug/ml)。混匀后，65℃空气浴15 min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5 min。

5.5 电泳：

5.5.1 将RNA样品小心加到点样孔中。

5.5.2 在5 V/cm下跑胶(5×14cm)。在电泳过程中，每隔30 min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝(500bp)接近胶的边缘时终止电泳。

5.5.3 紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。

注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。

5.6. 转膜

5.6.1 用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。

5.6.2用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。

5.6.3 连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜(膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5 mm)，膜在Transfer buffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。

5.6.4 盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。

5.6.5 将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2 mm，以防止漏气。

5.6.6 将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。

5.6.7 打开真空泵，使压强维持在50~58 mbar;立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面加上1 ml transfer buffer，真空转移2小时。

5.6.8 转膜后，用镊子夹住膜，于1× MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。

5.6.9 用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。

5.6.10 将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)

5.6.11 将膜在-20℃保存。

5.7 探针的制备

5.7.1 在1.5 ml离心管中配制以下反应液：

模板DNA(25 ng) 　1ul

Random Primer 2ul

灭菌水 11ul

总体积： 14ul

5.7.2 95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5 min。

5.7.3 在离心管中按下列顺序加入以下溶液：

10×Buffer 2.5 ul

dNTP Mixture 2.5 ul

111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul

Exo-free Klenow Fragment 1 ul

5.7.4 混匀后(25ul)，37°C下反应30分钟。短暂离心，收集溶液到管底。

5.7.5 65°C加热5min使酶失活。

5.8 探针的纯化及比活性测定：

5.8.1 准备凝胶：将1g凝胶加入30 ml的DEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。换用新配制的TE(PH7.6)。

5.8.2 取1ml一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填Sephadex G-50凝胶。

5.8.3 将注射器放入一支15 ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟，凝胶压紧后，补加Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9 ml刻度处

5.8.4 100 ul STE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。

5.8.5 倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5 ml离心管置于管中，再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5 ml离心管。

5.8.6 将标记的DNA样品加入25 ul STE，取出0.5 ul点样于DE8-paper上，其余上样于层析柱上。

5.8.7 1600g离心4 min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper.

5.8.8 测比活性(试剂比活要求:106 cpm/ml)。

5.9 预杂交：

5.9.1 将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。

5.9.2 加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100 cm2膜面积加入10 ml ULRAhyb杂交液)，42℃预杂交4 hr。

5.10 探针变性：

5.10.1 用10 mM EDTA将探针稀释10倍。

5.10.2 90℃热处理稀释后探针10min后，立即放置于冰上5 min。

5.10.3 短暂离心，将溶液收集到管底。

5.11杂交：

5.11.1 加入0.5ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。

5.11.2 42℃杂交过夜(14~24hr)。

杂交完后，将杂交液收集起来于-20℃保存。

5.12洗膜：

5.12.1 低严紧性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100 cm2膜面积加入20 ml洗膜溶液)，室温下，摇动洗膜5min两次。

5.12.2 高严紧性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 (100 cm2膜面积加入20 ml洗膜溶液)，42℃ 摇动洗膜20 min两次。

5.13 曝光：

5.13.1 将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。

5.13.2 检查膜上放射性强度，估计曝光时间

5.13.3 将X光底片覆盖与膜上，曝光

5.13.4 冲洗X光底片，扫描记录结果。

5.14 去除膜上的探针：将200ml 0.1%SDS(由DEPC水配制)煮沸后，将膜放入，室温下让SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。