northern blot 内参探针

对呀，和跑DNA的southern blot基本一样，在数据库检索序列片段，看外显子位置；但因为northern做的RNA是单链，需要和互补的RNA探针引物结合；所以在做northern的时候最好选择cDNA探针，若选用DNA探针，则尽量设计在外显子部分。此外， 探针长度最好在100-1000bp之间，大于1000bp则背景很高，很难区分异源序列

你可以直接在数据库搜序列然后premier5设计就好了原则上没有区别

你可以直接从数据库里面搜索，也可以用你的师兄弟们的内参探针，也可以参考已经发表的论文设计，但是你后续论文撰写阶段要说明探针序列来源。

探针设计的基本原则：

1.保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。

2.探针长度

Tagman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。现在有Tagman MGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高，即使探针片段较短，也可达到Tagman探针的Tm值要求(68-70℃)。

3.探针的名称

应标记探针在基因组的位置及长度。

4.探针Tm值计算

用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。确保探针中GC含量在30-80％。应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。

5.探针的评价

用DNAstar软件中的Primerselect?软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name”中输入探针的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的探针序列。选中整个序列后，在“report”菜单下“orimer selfdimeri”，分析探针的二聚体。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dimer，并对此探针用dG值进行评价（通常给出最差的dG值理论上是dG值越大越好)。在“report＇”菜单下“primer hairpinsi”，分析探针的发夹结构。

6.探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现

7.Tagman探针与引物之间的位置Tagman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠，要保证Tagman探针的5＇端离上游引物的5＇端至少有4bp。

探针设计原则1.探针需在反义链上:才能跟mRNA互补，启动子应在3'末端编码区。双链RNA探针需含有意义链和反义链。合成单链探针时要考虑合成的是反义RNA，启动子应在3末端。启动子的位置;在反义链3端使用启动子1产生的正义RNA探针，在反义链5端使用启动子2产生的反义链RNA探针。启动子的位置;在反义链3端使用启动子1产生的正义RNA探针，在反义链5端使用启动子2产生的反义链RNA探针。2.探针长度:在100-1000之间，大于1000则产生高背景，很难区分异源序列。如果用随机引物标记，探针长度为模板长度的一半。如果模板长度少于100，杂交温度和洗脱则按照寡核酸白心件进行。3.探针序列:探针应含有最少的非同源序列(探针尽可能含有跟模板误配的碱基。4.标记:放射性或非放射性标记。5.寡核苷酸探针:至少15bp，但标记效率差，灵敏度低。每一个杂交分子只有一个标记分子