核酸免疫实验

基 本 方 案 1 小 鼠 注 射 接 种DNA

在免疫前应先阅读动物处理（附 录 2C) 和 接 种 的（附 录 2E) 指导说明。在正式实验之前需先进行肌肉和皮下注射练习； D N A 的精准注射对于免疫成功起关键作用。可以 用 India ink (或相同的染料）来定位注射的部位是否正确。

材料

2 mg纯化的表达质粒DNA (见实验策略和CPI 单 元 10. 3)

无 菌 0.9% (m/V) 氯化钠

100 mg/m l盐酸氯胺酮

20 mg/ml 盐 酸 甲 苯 噻 曉（xylazine.HCl)

合适品系的小鼠

0.5 ml或 Im l的 2 7 号 或 3 0 号针头的注射器

解剖刀，仅用于肌肉内接种（可选）

外科手术用钉或缝合线，仅用于肌肉内接种

小鼠固定板，仅 用 于皮下接种（可选）

1.在 I.5m l的微量离心管中用乙醇沉淀2 mg纯化的表达质粒DNA (单 元 10. 1 中基本方案部分，步 骤 4〜8)。用 Iml无 菌 的 0 . 9 % 的氯化钠充分溶解质粒DNA，使其终浓 度 为 2 ugDNA/Ml。 4°C短暂保存或一20°C保存几周；避免反复冻融。

2.将足量的 DNA溶 液（一般为50ul)转移至0.5m l或 Im l的带有2 7 号 或 3 0 号针头的注射器中，排去所有空气。

肌肉内接种

3a. 配 制 5m ll00 mg/m l的氯胺酮和lm l20 mg/m l的甲苯噻嗪混合液，小鼠腹腔内注射30〜40W 的 上 述 混 合 液（或 用 0 •9 % 氯 化 钠I : 1 0 稀释，注 射 300〜400M 1 ) 麻醉小鼠。将小鼠腹部朝上平躺，在大腿内侧切幵一个Icm长的切口，使其暴露出股四头肌肌肉 。 一 般来说，用外科手术暴露肌肉注射的方案增加了肌肉内注射的可靠性
(图 1)

4a. 在膝盖上面0.5 cm 四 头 肌 肌 肉 处 以 30°角插入针头，针头斜面 朝 上 ，针头插入约0.2 cm深 。不要刺穿肌肉。当然也可选择其他的肌肉束，如胫腓骨前侧、二头肌，以及肩胛肌肉。在 至 少 30s 内 慢 慢 注 射 50/xl DN A盐 溶 液 。切口用外科钉或缝线缝合。

另外一种可供选择的方案不需要麻醉小鼠，只需在距针头头部0. 1〜0. 2 cm制作一个颈托，这可以确保针头不会刺穿肌肉。制作这个颈托的方案是，将 IOOul枪头的尾端切下一段，然 后 将 3 0 号针头穿过枪头，枪头的宽端紧靠注射器针筒，而窄端在针头上方约9 mm处，这样就可以保证不会刺穿肌肉，使用这一装置，就可直接注射到目标肌肉里。

皮下注射

3b. 麻 醉 小 鼠（同步骤3a) 或用一个小鼠固定板。针头插入尾巴根部皮下约0.2 cm，针头斜面朝上，呈 5°〜10°角 ，几乎是与皮肤平行的方向注射。慢慢注射SOiLtl DNA盐溶液。由于溶液的注入，水泡随之涨大。越到后面，需要更大的推力注射。注射时手要保持不动，要避免刺穿皮肤或将针头拔出。

基 本 方 案 2 小 鼠 基 因 枪 接 种DNA

材料

压缩氦气—纯度级别>4.5 ( 9 9 . 9 9 5 % ) ; 最 大 压 力 ， 2600psi(1psi =6.894 76 XIO³Pa)

合适品系的小鼠

存放包裹外源 D N A 的金粉颗粒的盒子（见辅助方案 2 ; 必须保持干燥）

基因枪和髙压氦气罐调节阀，单独购买或购买 Helios 基 因 枪 系 列（Bio-Rad)

电钳

耳 罩（如耳塞）

1 . 将压缩氦气同调节阀和基因枪连接，根据操作手册使用基因枪。

2 . 麻 醉 小 鼠（见基本方案 1，步 骤 3a; 麻醉是可选的），腹部剃毛。

3.将空弹盒装枪，开启氦气罐，戴上耳罩。将氦气压力表调至适当的压力（l Mm 金粉颗粒压力在 300〜500psi; 见 辅 助 方 案 3)。快 速 扳 动 扳 机 2 或 3 次 ，用氦气清洁基因枪。

4 . 从枪上去除空弹盒，装上包裹有外源 D N A 金粉颗粒的弹盒。

5.—只手将小 鼠 放 平（或用一只手捏住小鼠颈部，附 录 2C) ，使刮净的皮肤暴露并伸展 。将枪直接指在被刮净的腹部皮肤，与 之 呈 90°角 ，扣动扳机。在目标部位中间寻找褐色斑点。将小鼠放回笼子，观察其麻醉后苏醒情况。在 基 因 枪 接 种 后 IOmin 内被打区域将会适度发红。

1. 辅 助 方 案 1 包 裹 DNA 的金粉颗粒的制备

   可以参考表 , 表中概括了本操作中制备颗粒所需的各种值。
   
   
   

   辅 助 方 案 2 制 备 包 裹 有 DNA 的金粉颗粒的样品管

   
   

   超声水浴
   分 光 光 度 计（可选）

   1 . 按照操作说明，将氮气罐同调节阀门和样品管制备站连在一起。同 时 将 一 段 12〜13in (30. 5〜33 cm) 或更短的一段桂管通过 l /8in Luer 接头连到 IOml 注射器上。如果没有蠕动泵，准备第二个带有接头管的注射器用于去除乙醇。

   如果使用 Powderject 的样品管制备站，应使用一小段娃管（4in 或 10 cm)，将它同 IOml 注射器相连接，然后用封口膜封好。

   2 . 室温轻轻颠倒 DNA/金粉/乙醇的混合液。将装有颗粒的圆锥底离心管放在超声水浴中 5〜IOs 直到不存在块状金粉。

   3 . 用氮气清除空的聚四氟乙烯管道中的水气，时 间 不 少 于 15 min，有可能的话尽量长一些。将氮气压力调至 1〜2psi。通过调节管道旋转装置，将气流速度控制为 0.4〜0. 5L/min

   4 . 剪一段与管子转头相等的干燥的管道（约 30in 或 76. 2 cm) ，将此 管 与 IOml 注射器相连 ，再次轻轻颠倒 DNA/金粉悬液，用 注 射 器 将 悬 液（不多于 3 ml) 快速地抽至聚四氟乙烯管道中。管道的两端留 2〜3in (5〜7. 6 cm) 的空管子，此段空管中不要有任何液体。不要取走注射器，要防止在管道中留有气泡。

   5 . 确认氮气已经完全关闭，将上样管道接到管子转头上，将 DNA/金粉悬液在管道中保 留 4〜5 min。

   6 . 拔去上样注射器，将 蠕 动 泵（或者是第二个注射器）连接到样品管。以 每 秒 0.5〜lin (1.27〜2. 54 cm) 的速率用蠕动泵（或者注射器）将乙醇去除。有一小部分金粉随乙醇一起被去除是很常见的。

   为了在 DNA/金粉/ 乙醇混合液中以准确的速率均匀地去除乙醇，可以在样品管上 每 Iin 处做标记，用计时器定时，计算速度。此过程中不要用水，因为水会污染样品管制备站。如果使用 Powderject 的样品管制备站，上样注射器可以留在样品管上，一旦金下沉就可以去除乙醇了。

   7 . 拆下蠕动泵，用管子转头以 20r/min 的转速旋转管道。转动管子 30〜45s，直到金粉颗粒均匀落在管道上。

   8 . 通过调节阀，将氮气的流速控制在 0.35〜0.4L/min，使氮气在样品管中流动，让样品管充分干燥约 4 min，直 至 金 粉 从 黑 色（湿的）变 成 亮 棕 色（干的）。在管道末端看到一或两滴金粉是很正常的，而过多的金粉则说明管道中有水存在。

   9 . 停止转动管道，关上氮气，把管道从转子上取下。对着灯光观察管子中金粉分布情况 ，在金粉均匀分布的样品管两末端折缝或使用记号笔的方法做记号。只用有均匀涂层或绝大多数金涂层呈细金线的管道。

   如果金粉没有在管道内形成涂层，而形成一条很厚的金线，是因为乙醇去除的太慢了。如果金涂层呈漩涡或带状出现，是因为乙醇去除的太快了。如果金粉分布稀少或呈斑点状，有可能是 DNA/金粉/ 乙醇制备过程中污染了水，需要进一步干燥(步骤 10)。

   10.制备过程中污染水：记 下 制 备 好 的DNA/金粉/乙醇混合液体积，离心混合液，用新 鲜 的 无 水 乙 醇 洗 涤 沉 淀 3 〜 5 次。用 等 刻 度 的 新 鲜 无 水 乙 醇 重 悬 颗 粒 。用此DNA/金粉/乙 醇（步 骤 3〜9 ) 混合液制备样品管，空管子通氮气净化的时间要更长（步 骤 3〜9)。有必要的话，可以等天气不潮湿的时候来制备管道。

   11.用 刀 片 把 做 过 记 号 的 管 道 切 下 来 ，扔 掉 不 要 的 一 段 。将 剩 下 的 管 子 切 成 0.5in(1.27 cm)，最好用样品管切割仪或刀片切割管子。将管道放在有干燥剂的玻璃管中。用封口膜将盖子封口。管子可在 4°C 存 放 8〜1 2 个月。

   12.可选操作：样 品 管 中 DNA 含量的定量。将 5 个 样 品 管 放 在 有 500ul 的 PH8. O 的T E 缓冲液的 1.5 ml 微量离心管中，超声，直至金粉从管壁上脱落， DNA 复溶。最大转速离心约 5 min。用分光光度计测上清 A26。值 ，计 算 D N A 的含量。理论上说包被时如果 1 0 0 % 的 DNA 都包裹在金粉颗粒上，那 么 每 个 样 品 管 可 以 得 到 l Mg 的DNA，相当于 A260的值为 0.2

   辅 助 方 案 3 基因枪接种中氦气压力和颗粒大小的最优化

   

   1 . 麻 醉 小 鼠（见 基 本 方 案 1 ，步 骤 3a) ，用电动剃须刀给腹部剃毛。用基因枪在压力100〜500psi 范围内，按 IOOpsi 的增量在不同点接种包裹 DNA 的 金 粉 颗 粒（见基本方 案 2)。每个条件下接种 2 次 ，确定在腹部皮肤上的接种位点没有重叠，点与点外圈之间的距离约为0.5 cm，每个小鼠接种四个点。

   2 . 用皮肤打孔机活检接种过的点，这可在接种后数分钟内进行。按皮肤的方向将活检的皮肤放在 IinXlin 的卡片上。因为打过孔的地方很快就会愈合，不需要缝合。对进行过多次活检的小鼠可以实行安乐死（附 录 2 G)。

   3 . 将卡片上的活组织放在切片盒中，用 4 % 的多聚甲醛固定组织。用石蜡包埋并切片(CPI单 元 21.4)。用伊红染色，在显微镜下观察切片中颗粒的深度。

   在 所 有 的 切 片 中 ，在 角 质 层 、 表 皮 层 和 真 皮 层 都 可 以 发 现 颗 粒 。 对 各 层 中 的 颗粒进行计数，可以确定在哪种条件下，在表皮层的颗粒是占总量百分比最高的（通常 为 4 0 % 〜6 0% ) 。一般地，采用的压力变化至少在 IOOpsi 才会造成颗粒接种的深度明显不同。