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绝对定量是适合需要测定靶点实际拷贝数的研究人员采用 的实时荧光定量 PCR 分析方法。要进行绝对定量,需对 已知浓度的目标模板溶液进行几次连续稀释,采用实时荧 光定量 PCR 扩增,利用获得的数据生成标准曲线,标准 曲线以各靶点浓度及相应的 Ct 值绘制。然后将未知样本 的 Ct 值与此标准曲线进行比较,确定其拷贝数。
而溶解曲线是看引物特不特异的,按照常用的方法设置就好。①快速升温至 95℃,将反应体系中的模 板双链 DNA 全部变为单链 DNA,Analysis Mode 设置为 None,时间 20 秒,Ramp rate 4.4℃/s;②将 PCR 反应体系温度冷却至目标 DNA 的退火温度以下,系统默 认值为 65℃,Analysis Mode 设置为 None,时间 30 秒,Ramp rate 2.2℃/s;③将 反应体系温度缓慢升至 95℃,Analysis Mode 设置为 Continuous, Ramp rate 0.06℃ /s
天一湖医者
溶解曲线怎么设置,普通PCR的扩增产物通过电泳跑胶的方式来区分目的产物和非目的产物(引物二聚体、非特异性扩增产物)。
而且当从高浓度到低浓度做梯度实验时,我们从电泳图上往往可以看到3个结果:
1 全部目的产物
2 部分目的产物,部分非特异产物(比目的产物大或者小)
3 全部非特异产物
荧光染料是DNA双链小沟结合物,本身不具有选择性,能和所有的DNA双链结合。
在荧光PCR染料法里,我们单单通过PCR荧光扩增曲线来“判断”结果是否合适?
显然,单从荧光扩增曲线来“判断”结果是不合适的。
因为,非特异性扩增产物也能与染料结合,S型的荧光扩增曲线中有局部or全部的荧光来自非特异扩增的“贡献”。
鉴定并区分目的产物与非特异产物
显然,需要通过溶解曲线。
双链DNA都有自己的Tm值。可以通过Tm值的不同,将不同的产物分开。
在荧光PCR中,大多扩增100bp左右的产物(最好不超过200bp),退火和延伸时间较短。非特异的产物基本上都比目的扩增片段小。
所以,在做溶解曲线分析时,目的片段的Tm值较大,而非特异的Tm值较小。
二 降温速率
普通荧光PCR仪的降温速度默认是:1℃/cycle,能做HRM的仪器,降温速度可设置为<1℃/cycle。
一般来说,不做HRM,就设置1℃/cycle即可满足需要。
三 温度区间
理论上来说,能包含住产物Tm值和非特异产物Tm值即可。
所以,一般设置在50℃-95℃区间内均可。
四 荧光采集时间
若出于节省时间的考虑,用5s都可以有比较不错的结果。
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