方案4 氮舱减压法裂解培养细胞实验

通过来自增压舱中的氮气减压膨胀来破碎细胞是一种快速、有效的细胞和组织的匀浆方法，能释放完整的细胞器和制备细胞膜（Hunter and Commerford，1961)。该方法的原理很简单：细胞放在一个压力舱中，在高压下（约5500kPa，相当于800psi)氮气首先被溶解在细胞中，当压力突然消失时，氮从溶液中迅速气化，并引起细胞膜的拉伸和扩展，使之破裂，释放出细胞内容物。氮舱减压法适用于哺乳动物和植物细胞，以及一些细胞壁经过处理的细菌。但是这种方法在裂解酵母、真菌孢子或有坚硬细胞壁的细胞时效率较低。氮舱减压法的特征如下：

1.这是一种匀浆或分离细胞组分的温和方式，因为它施加于酶和亚细胞组分的化学和物理压力与其他超声波和机械匀浆的方式相比，是最小的。例如，从大多数类型的细胞中均可释放出功能完整的核和线粒体。

2.与许多依赖压力和摩擦力的细胞裂解方法不同的是，氮减压膨胀法不会产生热，因为这种方法通过隔热膨胀来冷却样品，而不是加热它。因而，蛋白和细胞器没有热损伤。

3.通过使用惰性气体氮气，可以保护任何不稳定的组分免于被氧化，而且氮气不会改变悬浮介质的pH值。

4.该过程快速并且均一，因为在每个细胞上和整个样品中施加了同样的破坏力，保证可重复产生无细胞的匀浆液。

5.大多数的市售产品都适用于很大的样品体积范围（如从约1ml到1L或更多）。

本方案改编自Konte Glass公司的“用户使用说明”，是为使用Kontes Mini Bomb细胞破碎舱来裂解小体积（1~15ml)组织培养细胞而设计的（见图3.2)。

注意：因为要产生高压，应在保护遮蔽物后进行操作。

1.确保出口关闭（但不要过紧），并把装置放入冰中预冷（如果有必要）。

2.准备要破碎的细胞或组织。

贴壁培养的细胞：用磷酸盐缓冲液（PBS)温和地洗细胞2?3次，用橡胶细胞刮刀，把细胞从培养器皿中刮到PBS溶液中。

非贴壁培养的细胞：400g离心10min，收集细胞，用PBS洗细胞2~3次。

动物组织：用机械匀浆器，纱网或过滤筛过滤，将组织绞碎。

3.4C条件下480g离心5min收集细胞。

4.去掉上清液，用10倍体积（约15ml)的匀浆溶液重悬细胞，然后转移上清至一个塑料烧杯（含有磁力搅拌棒）中，温和地搅动、混匀，以获得均一的悬浮液。

5.从冷却的细胞破碎舱中旋转、托出过滤支架。

6.在细胞破碎舱中加入15ml的细胞悬浮液。

若体积较大，可以用较大型号的破碎舱，也可以使用其他的氮气压力舱。

7.复位过滤支架。

8.通过拧紧压力舱顶部的螺丝，使之与无氧氮源连接起来，该螺丝应该已经连接在氮源上，只需一个扳手即可。

9.最好在低温下更换压力舱。

10.让氮气从汽缸流人破碎舱，加压到预期值。

必须有压力计显TK压力舱内的压力。所需的压力取决于要破坏的细胞的类型。一般使用的压力为：

（1）KB(人类口腔上皮癌细胞）细胞500psi(相当于3.45MPa)

（2）大鼠肝细胞500psi(相当于3.45MPa)

（3）鸡红细胞1OOOpsi(相当于6.9MPa)

每一次实验，步骤10必须选择最合适的预期值。一般，低压能更大程度地获得完整的细胞器，而高压则使匀浆更为彻底。难以裂解的细胞则需要多次处理，以获得更彻底的匀浆。破碎不同细胞所需的有效压力在表3.6中示出。

注意：没有经验的工作者处理高压气体时必须在使用汽缸前寻求专家的帮助。

11.将加压装置至少平衡30min，以便使氮气溶解并在细胞内达到平衡。在这期间用磁力搅拌器温和地搅动1~2次，或间断地温和晃动，以确保细胞处在均一的悬浮液中。

12.把收集容器（如烧杯）放在出口旁，并冰浴。

13.维持压力装置的工作状态（保持压力），缓慢打开出口，直到细胞悬浮液开始流人已经冷却的收集容器，在所有的悬浮液流尽之前要维持压力。

合理的流速是每秒3~10滴。当开始流出泡沫，表明装置内的液体几乎流完，同时会伴有微弱嘶嘶声。

随着压力的释放，细胞就会破裂，但是通过出口的微孔也会帮助细胞裂解。

注意：匀浆液由高压推出，因此操作时必须小心，尤其是当样品中含有危险物质时。由于有可能产生气态溶胶，该程序必须在保护通风橱内进行。

14.在对匀浆液离心或是后续操作之前，必须先温和地搅动，以消退泡沫。

15.关闭出口，但不要拧得太紧。

16.关闭氮源。

17.打开出口放气，并排空。当压力舱中的压力回复到大气压后，打开压力舱取出剩余的样品并彻底清洁压力舱。

注意：假如裂解的细胞材料有潜在的危险，使用一个合适的气阀来排放气体。

使用氮舱减压法破碎细胞的推荐工作参数如表3.6。