方案6 细菌中重组蛋白的大量提取实验

利用细菌获得用于纯化的重组蛋白是非常方便的。适用于细菌细胞蛋白提取的方法包括超声波处理、玻璃珠研磨、钒土或石英砂研磨、French 加压罐高压剪切细胞和溶’菌酶处理。这些方法适用于从各种革兰阴性菌和革兰阳性菌中制备蛋白提取物。通常是使用酶的方法破坏细胞，因为细胞在悬浮液中能获得相对均一的处理。下面讲述酶裂解 E.coli 的方法。

1.4°C、3000 g 离心 15 min 收集细菌。

2.用裂解缓冲液洗细胞，除去残留的培养基。重复步骤1，离心收集洗过的细胞。

3.倒出上清，称沉淀的湿重。

4.每克细胞沉淀用约 3 ml 裂解缓冲液重悬，4°C 条件下搅动悬浮液 30 min。如果沉淀物在 30 min 后没有完全悬浮，用韦林搅切器低速混合悬浮液 1min。

5.加溶菌酶至终浓度 1g/L，并在 4°C 条件下孵育 35 min，温和振荡。

增加溶菌酶的浓度至 10 mg/ml，可以加速裂解。如此，在 4°C 条件下，5 min 就可以获得充分的裂解（Bollag，etal，1996)。

6.按顺序加人如下试剂：

NP-40 至终浓度 5 g/L

MgCh 至终浓度 5 mmol/L

DNase I 至终浓度 40 ug/ml

4°C 搅动悬浮液 30 mm，除去黏性的核酸。

细菌提取物包含 40%~70% 蛋白、10%~30% 核酸、2%~10% 多糖和 10%~15% 脂类（Worral，1996)。细胞裂解过程中 DNA 的释放经常导致提取物高度黏稠，这可能在接下来的层析纯化步骤中引起严重的麻烦。除了用 DNase I 处理外，也可以加人带正电荷的化合物，如鱼精蛋白硫酸盐 (至 5 mg/g 沉淀湿重）（Scopes,1994) 或聚乙稀亚胺，通过中和溶液来除去细胞提取物中的 DNA(还伴有其他核酸，在一些情况下，还有高度酸化蛋白）（BurgossandJendrisak，1975)。

实验提示：用带正电荷的化合物除去 DNA 的方法不能用于包含体的提取。因为沉淀的 DNA 将与包含体一起被离心下来。

7.悬浮液在 4°C 条件下 23000 g 离心 30 min。

8.用含有 DTT 的 Laemmli 缓冲液重悬一小部分沉淀。

9.利用分析级 SDS-PAGE 分析可溶性蛋白组分（上清）和沉淀组分，找出目的蛋白存在的位置（见方案 1)。

如果目的蛋白位于难溶的沉淀组分中，则可能是形成了包含体，那么目的蛋白就需要依照实验方案 7 来溶解和纯化。若目的蛋白位于上清中，则将其贮存于 4°C，以备后续纯化方案使用。