质谱在蛋白质组学中的应用实验

1.吸取 0.5ul 的基质溶液，加到 MALDI-MS 分析所用的金属样品板上的样品孔中（为了准确起见，请使用2ul 的移液器）。 2.在基质干燥之前，迅速加入 0.5ul 的标准品或样品到基质中。 3.置于室温条件或 40℃ 的烘箱内约 5 min，让溶剂蒸发以使样品干燥。 4.把金属板转移到质谱仪的真空舱内。 5.以恰好高于离子化阈值的激光能量来「预

1.将 GELoader 移液吸头的尖端压扁。图 8.32 所示为两种最常用的操作方法： （1）将 GELoader 移液吸头的细端平放在坚硬的表面上，用一个 1.5 ml 的微量离心管滚过移液吸头尖端约 Imm 的部位。 （2）用平头镊子挤压 GELoader 移液吸头的尖端，然后将移液吸头旋转一圈，以封闭其末端。 2.制备溶于 70% 乙腈的层析树脂（Poro

1.GELoader 移液吸头的尖端压扁。具体方法参见方案 2(图 8.32)。 2.将 100ul 50 mmol/L NH4HCO3（pH 7.8）加入约 3 mg 的树脂，用于制备固定化胰酶的树脂悬液。 固定化胰酶树脂的浓度应随着固定在树脂上的酶量而变化。 3.将悬液加到空的 GELoader 移液吸头（由步骤①制备）中，然后通过一个黄色移液器头将装有树脂的

一、微型毛细管层析柱的构建 将一根聚酰亚胺毛细管的一端拉细至 5um 左右，其尖端可以起到过滤器的作用，同样也可以作为 ES1 的发射源。需在低分辨率显微镜下观察拉细的毛细管及填充的过程。 1.一根有聚酰亚胺涂层的 75um(内径）X 360um(外径）的毛细管上切下长 30 cm 的一段，用镊子夹住毛细管的一端，在丙烷喷灯上略为灼烧一下，以除去约 2~3 cm 的聚酰亚

一、纳升级液相色谱柱的制备 1.在溶融石英毛细管（大约长 12~15in，即 0.3~0.38m，100um x 365um）的中间部位除去聚酰亚胺涂层。操作如下：将毛细管放在酒精灯的火焰上烤至聚酰亚胺表层烧焦 (见图 8.37)，用蘸有甲醇的棉纸擦拭毛细管以除去烧焦的物质（见图 8.38)。 和酒精灯不同，本生灯的火焰太热，可致使毛细管内侧封堵，因此不适用。 2

##一、用于MuDPlT 分析的可溶性蛋白提取物的消化 1.用 1 mol/L NH4HCO3将蛋白提取物的pH值调至8.5。测定蛋白质浓度（该浓度可作为参考，以确定在步骤⑤和步骤⑦所需要加人的蛋白酶量）。 2.向蛋白提取物中加入固体尿素，至终浓度为8mol/L。 3.向蛋白溶液中加入DTT至终浓度lmmol/L，50°C赙育20 min。 4.将已变性的蛋白溶液冷却至室温，加入碘乙酰胺至

一、可溶性酵母蛋白的酶解 1.将 1mg 冷冻干燥的可溶性酵母蛋白加入0.5 ml 的变性溶液中，37°C 溶解 15 min。 2.加入 IAA 至终浓度为 50 mmol/L，然后将样品置于暗处 30 mm，室温条件下使半胱氨酸残基烷基化。 3.样品透析：将样品溶液在 100 ml 的透析液中室温透析 lh，以除去盐和低分子量物质。 4.更换透析液，重

一、变性、还原和缓冲液置换 1.在真空干燥器中浓缩 120 ug 混合蛋白样品，直至完全干燥。 2.将蛋白样品重新溶解在约 1ml 变性/还原缓冲液中，37°C 孵育 30 min，使样品变性还原。 体积不掃要非常精确，因为在下一步操作中缓冲液还需置换。不过样品体积越小，需要置换的时间就越短。 3.除去还原剂，降低尿素浓度以及除去缓冲液中的干扰成分。用约

第一阶段 ICAT 标记蛋白 第二阶段 阳离子交换清洗 ICAT 样品 第四阶段 ICAT 标记多肽的质谱分析 ​

一、培养细胞 二、提取蛋白的细胞准备 三、蛋白质提取 四、蛋白质分离 五、胶内酶解 六、蛋白质质谱分析 ​

一、ST-Sepharose 亲和树脂的制备 二、脱水胰酶的制备 三、脱水胰酶亲和柱的制备 四、样品制备、加样和洗脱 ​

一、IAV-胰酶膜的制备 二、固定化胰酶活性的检测 三、凝胶电泳分离蛋白质 四、胶的染色 五、蛋白质双平行消化 六、膜结合蛋白的染色（本步骤为选做） 将 PVDF 膜用 0.5% 的氨基黑染色 1 mm，然后用水脱色。 七、PMF 数据的采集 八、蛋白质的鉴定

一、样品的 2DPAGE 和电印迹 1.将细胞或蛋白质样品悬浮于变性缓冲液中，至浓度为 3 mg/ml，室温孵育 2 h。 2.必要时，室温条件下用 3 mmol/LTBP(以 20 mmol/L 的储存液稀释至工作浓度）还原蛋白质样品 2 h。 3.加入碘乙酰胺使蛋白质烷基化，室温条件下避光孵育 lh。 4.4°C 条件下，21000 g 离心 5 mi