方案3 固定化酶微型层析柱的制备

1.GELoader 移液吸头的尖端压扁。具体方法参见方案 2(图 8.32)。

2.将 100ul 50 mmol/L NH4HCO3（pH 7.8）加入约 3 mg 的树脂，用于制备固定化胰酶的树脂悬液。

固定化胰酶树脂的浓度应随着固定在树脂上的酶量而变化。

3.将悬液加到空的 GELoader 移液吸头（由步骤①制备）中，然后通过一个黄色移液器头将装有树脂的 GELoader 移液器头连接到合适的 Iml 注射器上，用注射器将悬液轻轻推到压扁的移液吸头尖端，制成一个层析柱。注意不能使层析柱干透。

黄色移液吸头必须被剪切两次，才能既适合注射器又适合 GELoader 移液吸头。NH4HCO3(50 mmol/L，pH7.8) 的最适 pH 值范围为 7.5 左右，可用于大部分蛋白酶。对于在其他最适 pH 范围和缓冲液条件下才能活化的酶，应考虑更换缓冲液。

4.每次用 30ul 的 NH4 HCO3 溶液（50 mmol/L，pH7.8) 清洗层析柱数次。在洗涤过程中严防层析柱干透。

也可以用含 10%(体积分数）乙腈的 50 mmol/LNH4 HCO3(PH7.8) 清洗层析柱。

5.将待酶解的蛋白质/多肽加到浸于 50 mmol/LNH4 HCO3 中的层析柱上。

6.利用注射器慢慢地、轻柔地将液体压过柱床，将流穿液收集到一个微量离心管中以备进一步分析。对于非常少量的蛋白质或肽段，或很稀的样品，可选择用反相微型层析柱进行蛋白质脱盐和浓缩（参见方案 2)。

实验提示：从酶层析柱中流出的穿透液可以反复再上层析柱数次，以确保酶解更加完全。

7.如果穿透液中蛋白质或肽段的含量很低，或为了追求洗脱的完整性，可用 5ul 含 10% 乙腈的 50 mmol/LNH4 HCO3(pH7.8) 溶液洗脱层析柱，然后将洗脱液与穿透液合并。

8.如果蛋白质（0.02~0.05ug) 或肽段（0.001~0.005ug) 的回收量达到 pmol 级，将少量穿透液与 2% 甲酸及相应的基质在 MALDI 板上直接混合。如果样品的量太低，需用反相微型层析柱先将步骤⑥和步骤⑦回收的样品脱盐和浓缩，详见方案 2。