方案4 用于蛋白质组分析的微毛细管 HPLC 色谱及 ESI —体化装置的制备和使用

一、微型毛细管层析柱的构建

将一根聚酰亚胺毛细管的一端拉细至 5um 左右，其尖端可以起到过滤器的作用，同样也可以作为 ES1 的发射源。需在低分辨率显微镜下观察拉细的毛细管及填充的过程。

1.一根有聚酰亚胺涂层的 75um(内径）X 360um(外径）的毛细管上切下长 30 cm 的一段，用镊子夹住毛细管的一端，在丙烷喷灯上略为灼烧一下，以除去约 2~3 cm 的聚酰亚胺涂层。然后将这段毛细管拉尖。

2.将拉细的一端放到洗净的食指（用 70% 的乙醇冲洗）上，然后用毛细管切割器将细端切齐，然后在 70% 的乙醇中浸蘸一下。为了确保 ES1 的工作质量，应在一台低分辨率（5~10 倍放大）显微镜下观察尖端是否平齐（不能参差不齐），尖端是否内径约为 5pm。

毛细管人工拉细操作的关键是要耐心。人工拉细毛细管的替代办法是从 NewObject1ves 公司（Woburn,Massachusetts) 购买已拉尖的毛细管，或者从 Sutter1nstruments 公司（Novato,Cal1forn1a) 购买激光拉针器。

3.用平勺将 50~100ul（干体积）的 C18 衍生树脂放人 1.7 ml 的离心管中。

实验提示: 因为 POROS(Appelera) 珠子的背压（backpressure) 较低，所以初学者以此开始比较好。

4.在 Cls 树脂中加人约 500ul 70% 的乙醇，混匀，然后进行短暂的超声处理（不超过 1 min)。

实验提示：因为 C1s 珠子会发生明显的不可逆变化，从而影响分离效果，所以其悬液最好现用现配。

5.把装着悬液的试管放人压力室（图 8.33)。

处理装有悬液的小管时最好使用镊子。压力室的内膛有许多小孔，可以插人不同长度的试管，对于较短的试管，应在底部放一些 Ki mwipes 纸巾，以使装有悬液的试管在膛内能达到适于操作的高度。

可以调节溶剂的黏度以控制装柱速度。

6.将毛细管未拉细的钝端从压力室的顶端穿入，即穿过螺栓、Teflon 塑料套圈和压力室的顶部（图 8.33)。插人压力室内的毛细管的前端应位于 500Jul 悬液的中部。

从仪器上面可以观察到毛细管，当看到毛细管开始弯曲时，表明毛细管已经到达试管的底部，然后将毛细管向上拔大约 0.5 cm。关上压力室的顶部，并确保 O 形圈位于正确的位置，然后用内六角扳手拧紧 4 个螺栓。再将压力室顶部控制毛细管的螺母拧紧，以确保毛细管位置正确。

警告：在打开氦气之前应确保 4 个螺栓都已拧紧。如果有缝隙，应关掉气体，并重新调整 O 型圈，或者重换新的再试一次。

7.调节压力调节器（二级、高压）至 1OOOps1(即 6.9MPa)。此时，毛细管层析柱已可以进行填充。通过旋转阀门 180°，缓慢增加压力室内的压力。当毛细管被填充到 1Ocm 后停止操作，也可以填充整个毛细管柱。然后，修剪毛细管层析柱至合适的长度。

8.当达到 0.5~1.0 cm 的理想填充长度时，除去压力室的压力，移走悬液，代之以一管 0.lmol/L 乙酸。再将仪器密封，打开压力阀，冲洗毛细管直至流出液变酸 (用 pH 试纸检验）。尽管在毛细管后部仍有一些未填充的硅胶粒，至此填充过程即可结束。

9.将层析柱的末端放入充有 50% 甲醇的 15 ml 聚丙烯塑料管中，进行密封后可以无限期保存。

二、系统适应性测试

LC-MS 系统装配完成后，应在分析宝贵的样品之前进行常规检测，以判断是否所有的部件都可以正常运行。如果使用相同条件对系统进行常规检测，而系统不符合要求，则可利用逻辑系统程序来纠正错误。因而，在使用 LC-MS 装置时，建议进行系统适应性检测，也就是对性质已知的样品进行分析。通常，最简单的样品是纯化的肽段，但也可以采用性质已知的其他任何样品。对于 LC-MS 系统来说，可以通过 4 个简单问题来评价系统的性能。以下将阐述应检测的系统参数。

1.质谱仪是否经过校准？通常是对比实测值和理论质量 [图 8.35(a)]。

2.HPLC 和 jlxLC(微型液相层析柱）是否正常运行？可比较实测的延迟时间和预期的延迟时间、检测 HPLC 的柱后压，以及通过单离子流图来计算单一分析物的峰宽 [图 8.35(c)]。

3.溶剂（和样品）干净吗？通过汇总洗脱峰的质量图谱，检测分析物洗脱峰处的信噪比 [图 8.35(b)]。由于静电和疏水性相互作用，分析物会携带一些性质不清的成分，这会降低信噪比；而过期的溶剂一般会增高噪声水平。

4.质谱仪是否经过正确调试？检测洗脱峰处的信噪比。因为质量图谱数据不是绝对的，所以检测信噪比比单纯检测信号更有意义。

在分析真正的样品之前，仅利用 LC-MS 分析的质谱数据就能够回答上述所有问题。为了给实验室内部或不同实验室之间的仪器提供性能比较的基础，最好标明所用系统的适应性测试条件。分析物应与完成分析和良好标定的测试物属于同一类型。例如，图 8.35 所示的数据来自 500fmol 的神经降压素，按照前面所述将其加入到 mLC 层析柱上，并用离子阱质谱仪分析。针对上述 4 个问题，对所获得的结果进行分析。

1.如果 HPLC 系统运行正常，能够按照程序传送溶剂，则肽段的洗脱时间应该可以重复。

2.如果洗脱时间超过预期范围，将导致或者 HPLC 系统不能按程序运行，或者层析柱失效。

3.如果峰形不对称或太宽（对 0.5~1.Opmol 的肽段标准品，应为大约 10~30s)(图 8.35)，那么可能是填充物存在问题，或者是 uLC 层析柱的某处存在死体积。

4.如果 HPLC-MS 能够正常工作，那么分析物的信噪比就应该超过经验值。图 8.35c 举例说明了如何对此进行计算。为便于示范，纵坐标放大扩展到正常的 200 倍。通过扩展纵轴直至单电荷信号被噪声掩盖，以此来估计信噪比。如果分析物的信噪比低于可接受的值，那么或许应该改变溶剂，或者重新调试质谱仪，或者需要清洁离子聚焦的透镜。当透镜被一层薄不可见的物质（例如来自于重复分析的样品）覆盖时，施加的电压就不再等于离子正常通过时的场电压，因而导致仪器性能（例如信噪比）有所降低。

5.如果分析物的理论分子量和实际观察到的分子量在质谱仪容许的误差范围之夕卜，那么也许只是设备需要清洁，并在清洁后进行调试和校准。

遵循这些步骤将有助于初学者快速检修复杂的 LC-MS 设备。最佳灵敏度应该采用上样量为 5amol(10^-18mol) 的标准肽段—这对于他们是一个挑战。

三、酵母裂解混合物的分析

来自酵母全细胞裂解物的蛋白质可按照下列步骤进行胰酶酶解和 MS 分析前处理。

1.将酵母全细胞裂解物沉淀（含蛋白）重悬在 0.5 ml 的 50 mmol/L NH4HCO3(PH8.3) 和 0.5% SDS 溶液中，60°C 条件下孵育 30m1n，期间间断地涡旋振荡几次以使之溶解。得到的混合物用 50 mmol/LNH4 HCO3(PH8.3) 稀释，直至 SDS 浓度为 0.05%。按照酶：底物为 100:1 的比例加人修饰过的胰酶，37°C 孵育过夜。

2.在进行 LOMS 分析前，将得到的肽段用 OAS1S MCX Cartridge 进行纯化 (依仪器使用手册进行）。

3.将输送自 DIONEXFAMOS 自动加样器内酸化的肽段混合物加到孔 3(图 8.34) 相连的 C18 预柱，液流通过六通阀（孔 4) 直接流入废液缸。

4.用 100% 溶剂 A 清洗 5m1n 后，关闭转向阀，液流转向 10 cm X 75 um(内径) 的 pLC 层析柱（孔 1)，该层析柱也作为 ES1 的喷针。在液流进入毛细管柱的同时，来自 Ag1lent1100 HPLC 的乙腈（溶剂 B) 线性梯度洗脱开始进行。为降低质谱的化学噪声，溶剂 B 中不能有酸。线性梯度从 2%~45%，梯度时间为 60m1n。泵的最初流速为 l00 ul/min。

5.在自动加样器和层析柱之间，接一个空的聚酰亚胺毛细管（其规格必须根据经验设置）作为分流器，图 8.34 所示装置的流速是 300nl/min。图 8.34 所示的 Up churchScientific 四通阀的孔径为 0.006 in(0.15 mm)，该四通阀由位于 Thermo Finniigan ITMS 上的特殊装置（购自 Brechbuhler，inc.，Spring，Texas) 固定在恰当的位置。

6.对孔 2 施加高压以开始电喷雾。进行 C1D 的离子通过自动程序选择，即使用「自上而下」（top-down) 的数据依赖型离子选择方法对最强的三个离子进行 MS/MS，包括 3m1n 的动态排除时间，以阻止在整个 pLC-ES1-MS/MS 分析过程中已经选择过的离子被不断重复选择。

7.1ug 的复杂肽段混合物（通过测定的蛋白浓度进行估算），根据上述步骤进行 uLC 层析柱进行分离，洗脱的肽段利用离子阱质谱仪进行 C1D。分析装置如图 8.34 所示。

8.肽段离子在较宽的 m/z 范围（400~2000) 通过数据依赖型方法被选择出来进行 C1D，动态排除时间为 3 min，以阻止已经被 C1D 处理的高丰度离子被重新选择。

9.酵母蛋白通过其肽段的串联质谱谱图用 SEQUEST(Eng，etal，1994) 检索数据库，进行蛋白质鉴定。图 8.36 举例说明了实验所得到的一个典型的离子峰。

对样品重复进行 3 次 uLC-ES1-MS/MS 分析，鉴定出 401 种蛋白，要求所有正确匹配肽段的序列都具有与酶切特性一致的氨基和羧基末端，所使用的评分体系为已知能够正确鉴定蛋白的一套标准评分系统（Keller，2002)。图 8.36 所示为两个肽段的串联质谱图及两者的 SEQUESTXcorr 和 dcon~得分，鉴定结果表明两个肽段属于两个不同的蛋白。目前，即使是利用上述特定的标准，SEQUEST 的数据库搜索的结果还要进行人工判定，因为 SEQUEST 得分高的并不总是正确匹配的肽段序列。不过，在不远的将来，在使用 SEQUEST 或其他专用软件进行分析时，可在进行数据库搜索之前通过一些软件，例如 QSCORE(Moore，etal，2002)，对串联质谱图按照质量好坏进行筛选，以增加数据库匹配的正确性。这种工具将大大提高专用系统处理海量数据的能力。