方案2 反相微型层析柱的制备实验

1.将 GELoader 移液吸头的尖端压扁。图 8.32 所示为两种最常用的操作方法：

（1）将 GELoader 移液吸头的细端平放在坚硬的表面上，用一个 1.5 ml 的微量离心管滚过移液吸头尖端约 Imm 的部位。

（2）用平头镊子挤压 GELoader 移液吸头的尖端，然后将移液吸头旋转一圈，以封闭其末端。

2.制备溶于 70% 乙腈的层析树脂（PorosR1、PorosR2 或 Oligo R3) 悬液 100~200ul(约 1.5 mg 树脂/100ul 乙腈）。

步骤③~⑧的操作如图 8.32(b) 所示。

3.把 20ul 70% 的乙腈装人压扁的 GELoader 移液吸头的尖端，在乙腈上面加人0.5 沁的树脂悬液，然后通过一个一次性的移液吸头将装有树脂的 GELoader 移液吸头连接到合适的 1ml 注射器上，用注射器将液体轻轻地压出。如此，在压扁的微型层析柱的末端形成一个小的层析柱床。在进行下一步实验之前，让所有的液体流出柱底，并使层析柱干燥。

黄色移液吸头必须被剪切两次，才能既适合注射器又适合 GELoader 移液吸头。用来制备层析柱的树脂悬液的量应该随着样品的浓度而变化。

总的说来，当分析物为凝胶分离的低丰度蛋白的肽段时，层析柱的高度应该在 1?6 mm(柱床体积大约为 10~60 nl)。

4.在层析柱顶端加人 20ul 0.1% 的三氟乙酸。由注射器产生的空气压力轻轻地将 IOul 0.1% 的三氟乙酸推过层析柱，使其平衡。剩余的 10ul 0.1% 的三氟乙酸则存留在尖端的柱床上面。

注：当微型层析柱被用作 nano-ESI-MS 的预处理步骤时，应以 1% 的甲酸替代三氟乙酸，因为三氟乙酸与电喷雾离子化质谱仪不相容。

5.把蛋白质/多肽样品加到存留的 10ul 0.1% TFA 上面。

6.通过注射器施加空气压力，把液体轻轻地推过层析柱。注意层析柱绝对不能干掉，在柱床的顶端要留有约 2ul 的溶液。

7.用 20ul 0.1% 的 TFA 清洗层析柱，让层析柱自然流尽。

8.用 0.5ul 的基质溶液，将分析物直接洗脱到 MALDI-MS 板上。这 0.5ul 的基质溶液应分为几滴（5~10 滴）点在板上。另外，分析物也可用 ESI-MS 分析，此时以甲醇/甲酸/水（50:1:49) 把多肽从层析柱中直接洗脱到毛细管喷针或者微量离心管中。

注：用于从层析柱中洗脱蛋白质的 MALDI 基质或是芥子酸（SA)，或是 2,5-二羟基苯甲酸（DHB)，均溶于 50% 乙腈/0.1% 三氟乙酸中。用来洗脱多肽的基质为溶于含 0.1% 三氟乙酸的 70% 乙腈中的 HCCA。另外，用任何比例的有机试剂都可将分析物直接洗脱到微型离心管中，用于贮存或进一步分析。当分别洗脱到几个样品点中时，仅前 2~3 个样品点中含有分析物，也就是说样品得到了进一步的浓缩。

层析柱用 100% 乙腈彻底清洗后可以重复使用。层析柱可被重复利用 2~10 次而没有任何残留效应，这与层析柱的大小和装载到层析柱上的分析物的丰度/浓度有关。